羥氯喹對MBL/lpr狼瘡鼠激素性股骨頭壞死的影響

李潔，張乾坤，金烈

（麗水市中心醫院，浙江 麗水 323000）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）好發于育齡期女性，通常需終生服用糖皮質激素（以下簡稱“激素”）控制病情。長期和/或大劑量的激素使用會導致一系列的嚴重并發癥，如感染、骨質疏松、股骨頭壞死等，其中SLE股骨頭壞死的發生率約5%～10%[1]。由于SLE患者以青年女性多見，一旦發生股骨頭壞死，致殘率極高，給患者帶來社會、經濟、心理上的多重壓力。羥氯喹是SLE的基礎用藥，除免疫抑制作用外，根據其抗凝、抗血小板及降脂的作用，長期服用可顯著降低心血管事件的發生率[2]，部分回顧性研究發現，羥氯喹對股骨頭壞死亦有保護作用[3-4]。本研究主要評價羥氯喹對MBL/lpr狼瘡鼠激素性股骨頭壞死的保護性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 16周齡MBL/lpr雌性狼瘡鼠，體質量36～38g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（滬）2017-0008，飼養在溫州醫科大學動物實驗中心清潔級（SPF）動物房中。實驗藥物：羥氯喹購自上海上藥中西制藥有限公司 （100mg×14片），批號：H20123414；甲強龍針購自美國輝瑞制藥有限公司（40mg/支），批號：H20080284。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將全部小鼠隨機分為3組，即對照組、模型組和羥氯喹組，每各10只，其中對照組不予造模和給藥，模型組參與造模但不給藥，羥氯喹組于造模成功后當天給予口服羥氯喹 （10mg/kg，化入水中）1次/d，模型組及對照組每天飲同等量水。

1.2.2 造模 造模動物自由進食與飲水，每天試紙條法測尿蛋白，如出現尿蛋白“+”以上結合血抗雙鏈-DNA抗體陽性則認為狼瘡發病，當天即開始造模。予脂多糖（LPS）10μg/kg腹腔注射，24小時后予甲強龍20mg/kg肌肉注射3次 （每次間隔24小時），同時造模當天起口服復方磺胺甲惡唑片（40mg/kg，溶解于水），隔天1次，以預防感染。

1.3 標本收集和檢測 自造模開始第1天為第1周起始時間，于第8周末處死所有小鼠，處死前24小時起留取24小時尿，處死后取血標本和雙側股骨頭標本做進一步的研究。

1.3.1 血、尿標本的采集和分析 （1）10%水合氯醛腹腔注射麻醉后針刺心臟采血，于-20℃冰箱中保存，待測各項指標。反應凝血功能的指標凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶原時間（APTT）及反應血脂的指標總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）的測定采用相應自動化檢測儀；反應內皮細胞損傷的指標一氧化氮（NO）的測定采用硝酸還原酶法。（2）動物處死前1天用代謝籠收集24小時尿量，在收集容器中放入少量甲醛溶液，離心后保存于-20℃冰箱中，待測24小時尿蛋白。采用考馬斯亮藍法測定尿蛋白濃度，計算24小時尿蛋白定量，24小時尿蛋白定量=尿蛋白濃度×24小時尿量。

1.3.2 股骨頭病理組織學分析 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出雙側股骨頭，DEPC水配制的PBS溶液沖洗后，置于體積分數為10%的多聚甲醛溶液固定，用于病理檢查。股骨頭固定24小時后，10%EDTA脫鈣，系列酒精脫水，石蠟包埋，常規切片，厚約5μm。每個標本取兩張切片，切片間隔約100μm，常規HE染色。在光學顯微鏡下觀察切片，并計算各項指標。（1）股壞死的定義[5]：兩張切片至少有一個壞死病灶則定義為骨壞死陽性，檢查部位均未發現壞死病灶則定義為骨壞死陰性。（2）空骨陷窩率計算[5]：每張切片以股骨頭軟骨下區為中心，上下左右隨機選取4個視野，每個視野內計數空骨陷窩數（K），再計數總骨陷窩數（T），空骨陷窩率=（K/T）×100%，將4個數值的平均數作為該切片的空骨陷窩率。兩張切片的平均值作為該標本的空骨陷窩率。

1.4 統計學處理 統計分析用SPSS16.0軟件，所有計量資料以（±s）表示，計數資料以中位數或百分率表示，組間差異采用方差分析或χ2檢驗。

2 結果

2.1 實驗室指標 至第8周末，對照組、模型組、羥氯喹組各有9、7、8只小鼠存活。模型組與對照組比較，模型組小鼠PT、APTT較對照組明顯縮短，而模型組小鼠的TC、NO含量較對照組明顯升高，差異均有統計學意義 （均P＜0.05）。比較模型組與羥氯喹組，羥氯喹組PT、APTT明顯加長，TC、NO含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 股骨頭病理組織學分析

表1 三組實驗室指標比較（±s）

表1 三組實驗室指標比較（±s）

與對照組比較#P＜0.05，與模型組比較*P＜0.05

2.2±0.6 1.9±0.7羥氯喹組 8 1 2.2±0.3*4 1.2±6.8*1.3±0.5 3.8±1.1*1 5.2±3.7*2.1±0.3 2 4小時尿蛋白（g）對照組模型組組別 n P T（s）A P T T（s）T G（m m o l/L）T C（m m o l/L）N O（n m o l/L）9 7 1 2.1±0.3 1 1.2±0.4#3 7.5±7.4 3 2.7±8.6#1.5±0.4 1.8±0.6 4.9±1.2 6.5±1.3#2 3.4±6.4 3 0.4±5.4#

2.2.1 大體表現 對照組股骨頭大多外觀形態正常，關節軟骨面光滑、平整，軟骨色澤紅潤；模型組大多出現局部關節軟骨面粗糙，可見散在出血點及大片瘀斑，關節面呈灰白色，骨質硬度下降，脆性增加，易于鑿取；羥氯喹組病變程度雖然較對照組加重，但較模型組明顯減輕。

2.2.2 鏡下表現 對照組骨小梁完整，排列規則，骨小梁中的骨細胞清晰可見，空骨陷窩少見，造血細胞豐富，脂肪細胞相對較少，形態正常；骨髓腔內血管分布均勻，未見血管出血（圖1A）。模型組骨小梁結構紊亂，廣泛地骨小梁斷裂、稀疏、纖細，可見大量的空骨陷窩；骨髓腔內脂肪細胞增多、增大明顯，并出現脂肪細胞互相融合，造血細胞減少明顯（圖1B）；羥氯喹組病變程度較模型組減輕 （圖1C）。模型組股骨頭壞死發生率較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；羥氯喹組與模型組在股骨頭壞死率方面差異無統計學意義 （P＞0.05）。在空骨陷窩率方面，模型組較對照組明顯增加，羥氯喹組較模型組明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。 詳見表 2。

表2 三組股骨頭壞死及空骨陷窩率比較

3 討論

股骨頭壞死分為創傷性和非創傷性，其中激素性股骨頭壞死是非創傷性股骨頭壞死的首要成因。其確切的發病機制仍不清楚，目前有多種假說，包括血管內凝血學說、血脂代謝紊亂學說、內皮細胞損傷學說、細胞凋亡學說、骨質疏松學說等[6]。既往研究表明，SLE發生股骨頭壞死的最主要危險因素是大劑量激素的使用，特別是接受過激素沖擊治療者[2-3]。且SLE較其他疾病股骨頭壞死率升高，來自日本的一項大規模的流行病學調查發現[7]，激素性股骨頭壞死的患者中31.2%為SLE，排名第二的腎病綜合征僅6.3%。這可能是與SLE體內存在補體激活產物、免疫復合物、細胞因子、抗磷脂抗體等物質，導致血管內皮細胞受損，導致的明顯血栓形成傾向有關[8]。而激素的大劑量使用能使血管內皮細胞損傷及血管內高凝狀態進一步加重，大大增加了股骨頭壞死的風險。

圖1 小鼠股骨軟骨微形態變化。1A：對照組髓腔內血管分布均勻，未見血管出血；1B：模型組骨髓腔內脂肪細胞增多、增大明顯，并出現脂肪細胞互相融合，造血細胞減少明顯；1C：羥氯喹組髓腔內脂肪細胞較模型組減少，造血細胞輕度減少。

羥氯喹是一種抗瘧藥，通過弱化抗原表達和遞呈、抑制細胞介導的細胞毒作用、抑制IL-1等炎癥因子釋放、降低循環免疫復合物等機制，發揮抗炎和免疫調節作用，現被廣泛用于風濕性疾病的治療，如SLE、類風濕關節炎、干燥綜合征、抗磷脂抗體綜合征等。此外，在使用羥氯喹抗風濕治療的同時發現其相關作用[2，9]：（1）可一定程度抗血小板聚集，存在抗凝抗血栓的作用；（2）具有很好的脂代謝調節作用，能降低總膽固醇、甘油三酯、極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白，對于接受激素治療的患者該作用明顯；（3）具有抗動脈粥樣硬化作用，通過對抗血管炎癥和抗氧化，從而減少血管內皮細胞功能紊亂，預防動脈粥樣硬化的形成。本研究結果顯示，SLE股骨頭壞死小鼠服用羥氯喹后，PT、APTT較模型組明顯延長，TC以及血NO明顯降低，且股骨頭空骨陷窩率有明顯的減小（均P＜0.05），證實了羥氯喹對激素性股骨頭壞死的SLE小鼠有抗凝血、降脂和抗炎作用。在一項SLE患者股骨頭壞死危險因素的回顧性研究中發現，羥氯喹是股骨頭壞死保護因素[3-4]。

有狼瘡背景的MBL/lpr小鼠建立激素性股骨頭壞死給予羥氯喹干預，發現羥氯喹可顯著改善激素性股骨頭壞死的發生，這種預防作用很可能是通過改善高凝狀態、內皮細胞功能紊亂、血脂代謝異常等實現的，確切的機制仍需進一步研究。