兒童EB病毒感染肝功能損傷與Caspase-7水平的關系

胡玲瓏，王菊香，周海霞，李原

（溫州醫科大學附屬第二醫院、育英兒童醫院，浙江 溫州325000）

EB病毒是非嗜肝病毒感染引起兒童肝損害的常見病原體，原發性急性EB病毒感染可導致82%的患兒出現肝功能損傷[1]，大部分患兒的癥狀會在治療1周內減退[2]。目前，對EB病毒感染導致肝功能損傷的機制尚未完全明確。Caspase-7是導致肝細胞凋亡的主要分子蛋白，但是否與原發性EB病毒感染導致的肝功能損傷存在相關性，目前尚未明確。本文探討了原發性EB病毒感染肝功能損害與Caspase-7表達變化的相關性及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1-12月在本院治療的原發性EB病毒感染患兒236例，EBV-IgM檢測均為陽性，其中肝功能正常74例為肝功能正常組，其中男 38例，女 36例，年齡（5.2±1.6）歲；伴肝功能損傷162例為肝功能異常組，其中男91例，女71例，年齡（4.8±1.5）歲。檢測肝功能異常組急性期及恢復期的實驗室指標，恢復期抽血時間為更昔洛韋針治療第7天 （EB病毒感染更昔洛韋的常規住院治療時間為 1 周）， 收集肝功能（AST、ALT、TBLL）數據，兩組性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經患者知情同意并經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 ALT、AST采用全自動生化分析儀檢測，TBLL檢測試劑由浙江東歐診斷產品有限公司提供，ALT、AST和TBLL檢測儀器均為德國西門子ADV2400。用ELISA法檢測血清Caspase-7蛋白的表達水平，試劑盒為美國PeproTech公司生產，抗Caspase-7抗體購自英國abcom公司。取Caspase-7酶聯免疫試劑盒，室溫下靜置30分鐘，每孔加50μL標準樣品或待測樣品，留兩孔為空白對照孔；塑料薄膜覆蓋微孔板，孵育2小時；洗板4次，反轉酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔加50μL生物素標記的抗Caspase-7抗體，塑料膜封板，孵育2小時；洗板4次，反轉酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔依次加入顯色劑A和顯色劑B，避光室溫孵育30分鐘；加入反應終止液100μL，自動酶標儀于450nm處測定各孔的光密度 （optical density，OD）值，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據樣品所測OD值確定其濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0軟件對數據進行分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，兩組數據采用雙變量相關性分析。

2 結果

2.1 肝功能和Caspase-7表達水平比較 肝功能異常組ALT和Caspase-7兩指標在急性期和恢復期比較差異均具有統計學意義（均P＜0.01），肝功能異常組急性期ALT和Caspase-7的表達水平明顯高于肝功能正常組，差異具有統計學意義 （均P＜0.01）。詳見表 1。

表1 各組肝功能指標及Caspase-7表達情況（±s）

表1 各組肝功能指標及Caspase-7表達情況（±s）

與肝功能異常組急性期比較**P＜0.01，與肝功能正常組比較△△P＜0.01

組別 n A L T（U/L）A S T（U/L）T B L L（μ m o l/L）C a s p a s e-7（n g/m L）肝功能正常組 7 4 1 8.3±1.5 3 2.3±1.7 2 1.9±1.7 1 9 5.5±3 2.4肝功能異常組急性期 1 6 2 7 4.2±6.4△△ 3 1.7±1.9 2 2.4±1.9 9 3 2.2±8 6.5△△恢復期 1 6 2 3 3.4±2.3**3 2.1±2.5 2 2.6±2.1 4 7 8.5±4 9.2**

2.2 Caspase-7與ALT相關性分析 Caspase-7與ALT相關性分析肝功能異常組急性期Caspase-7表達水平與 ALT 呈高度正相關（r=0.965，P＜0.01）（圖1），肝功能異常組恢復期Caspase-7表達水平與ALT 不存在正相關（r=0.109，P＞0.05）（圖2）。

圖1 肝功能異常組急性期ALT與Caspase-7的相關性

圖2 肝功能異常組恢復期ALT與Caspase-7的相關性

3 討論

EB病毒是臨床上最常見的導致兒童肝損傷的非嗜肝病毒，屬4型皰疹類病毒。肝功能損傷是原發性EB病毒感染最常見的并發癥之一，但EB病毒感染如何導致肝損傷，其病理生理機制目前尚未完全明確。國內新的研究表明，EB病毒感染與乙肝病毒感染誘導的肝損傷存在相似性，可能與B淋巴細胞活動存在某種協同作用[3]；Zekri等[4]在臨床研究丙肝時發現，如果EB病毒感染處于活動期，患者的轉氨酶升高明顯；2000年有研究揭示EB病毒感染可以激活機體免疫相關因子，進而導致各臟器損傷，主要表現為細胞的凋亡[5]，在誘導細胞凋亡的整個過程中細胞內Caspase系列蛋白酶的激活起著重要作用，提示Caspase系列蛋白可能參與了EB病毒感染致肝功能損傷的病理生理過程。

目前，已經明確的凋亡通道有三種，分別是Caspase-8參與傳遞的細胞外信號凋亡通路，Caspase-9參與介導的線粒體途徑誘導的細胞凋亡，以及Caspase-12參與誘導的內質網應激細胞凋亡信號通路，在這三條Caspase參與介導的細胞凋亡信號通路中，最后都需經過Caspase-7產生效應[6]。眾多文獻也提示，肝炎肝細胞的損傷一般表現為凋亡的過程，并且和Caspase系列蛋白分子依賴的細胞凋亡過程緊密相關，其中Caspase-7的作用最顯著。在乙肝、丙肝的臨床實驗中，大部分患者血清中Caspase-7的表達水平明顯升高[7-8]，Masuoka等[9]在細胞實驗中通過使用Caspase抑制劑來治療丙肝，取得了顯著的效果，但Caspase-7與原發性EB病毒感染誘導的肝功能損傷是否存在內在的相關性，目前尚未完全闡明。

既往在對丙肝的研究中發現，血清中Caspase-7分子表達的上升可直接導致肝細胞凋亡，繼而出現肝功能損傷，在使用Caspase蛋白分子抑制劑后，Caspase-7蛋白分子表達水平明顯下降，部分患者轉氨酶也下降。本文發現原發性EB病毒感染后患兒血清中Caspase-7的分子水平上升明顯，肝功能異常組急性期Caspase-7分子的表達水平也明顯高于肝功能正常組，與既往研究一致；而急性期患兒血清中的Caspase-7表達水平以及ALT較恢復期患兒明顯升高，說明EB病毒導致患兒肝功能受損，同時Caspase-7水平也升高。本文又對肝功能異常組急性期和恢復期的Caspase-7和ALT進行相關性分析，發現當患兒感染EB病毒后處于急性期，肝功能惡化時ALT升高，Caspase-7的表達水平也隨之升高，急性期Caspase-7的表達水平與ALT呈正相關（r=0.965）；而當EB病毒感染患兒處于疾病恢復期時，ALT下降Caspase-7水平也隨之下降，但下降不明顯，兩者之間不呈正相關。提示原發性EB病毒感染誘導的肝功能損傷與Caspase-7之間呈正相關，該相關關系以急性期最明顯。

既往的研究認為，ALT才是提示肝功能急性損傷的最佳指標，早期AST和TBLL升高不明顯，故本文出現肝功能異常組AST及TBLL指標急性期和恢復期無差異。