補中益氣湯對念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護作用

林通++張玉奇+李小悅

[摘要]目的 探討補中益氣湯對念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護作用和機制。方法 40只雄性昆明小鼠經環磷酰胺（CTX）預處理后腹腔注射白念珠菌混懸液，制作念珠菌感染小鼠模型，分成對照組（n=20）和試驗組（n=20）。對照組給予抗真菌治療，試驗組給予抗真菌聯合補中益氣湯治療，觀察兩組生存率、線粒體生成指標（PGC-1α mRNA）、氮化應激指標（NO、總NOS、iNOS）和肝臟病理。結果 試驗組生存率顯著高于對照組，差異有統計學意義（70% vs. 30%，P=0.011）。試驗組PGC-1α mRNA顯著高于對照組（P<0.05）；試驗組氮化應激指標顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。光鏡下試驗組小鼠肝臟肝竇充血較對照組減輕。結論 補中益氣湯通過抑制氮化應激保護念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能，促進肝細胞線粒體生成。

[關鍵詞]念珠菌感染；補中益氣湯；線粒體；氮化應激

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）1（c）-0117-03

Protective effect of Buzhong Yiqi Decoction on liver mitochondrial function in mice infected by candida albicans

LIN Tong1 ZHANG Yu-qi2 LI Xiao-yue2

1.Family Planning Service Center，Maternal and Child Health Care Hospital of Pingyuan County，Guangdong Province，Pingyuan 514600，China；2.Department of Critical Care Medicine，the Second Affiliated Hospital，Guilin Medical College，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin 541199，China

[Abstract]Objective To discuss the protective effect of Buzhong Yiqi Decoction on liver mitochondrial function in mice infected by candida and its mechanism.Methods 40 male Kunming mice were given intraperitoneal injection of candida albicans suspension after pretreatment by CTX and then made into models infected by candida albicans and were randomly divided into the control group （n=20） and experimental group （n=20）.Mice in the control group were given Antifungal therapy，while mice in the experimental group were given antifungal drug combined with Buzhong Yiqi Decoction.The survival rate，mitochondriopoiesis index，nitrosative stress index and hepatic pathology were observed.Results Survival rate was significantly higher in the experimental group than that in the control group（70% vs. 30%，P=0.011）.The level of PGC-1α mRNA was significantly higher in the experimental group than that in the control group（P<0.05）.The nitrosative stress index was significantly lower in the experimental group than in the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion of hepatic sinusoid observed by light microscope was lighter in the experimental group than that in the control group.Conclusion Buzhong Yiqi Decoction may protect the liver mitochondrial function and facilitate mitochondriopoiesis in mice infected by candida albicans via inhibition of nitrosative stress.

[Key words]Candida infection；Buzhong Yiqi Decoction；Mitochondria；Nitrosative stress

念珠菌感染病機特點為本虛標實，邪盛正衰[1]。補中益氣湯為宋代李杲《內外傷辨惑論》之方劑，具有補中益氣、升陽舉陷之功，是臨床上治療脾虛證的經典方劑[2]。研究表明，補中益氣湯可提高脾氣虛動物模型免疫器官指數，有助于提高免疫功能[3]。念珠菌感染容易發展為多器官功能不全綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），其中肝臟是最常見的受損器官之一[4]。線粒體結構和功能的改變參與了膿毒癥發生、發展的過程[5]。本研究主要探討補中益氣湯對念珠菌感染動物模型肝臟線粒體的保護作用和可能機制。endprint

1對象與方法

1.1實驗動物

昆明小鼠共40只（雄性，體重20～25 g），由中山大學實驗動物中心提供[6][SCXK（粵）2009-0011]。實驗開始前2 d予環磷酰胺預處理，劑量分別為200 mg/kg、100 mg/kg；實驗開始后第4天予環磷酰胺200 mg/kg。白念珠菌（ATCC90028，沙保弱培養基37℃培養48 h）配制標準混懸液（1×109 cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混懸液方法建立念珠菌感染動物模型。

1.2主要儀器與試劑

參照2010年《中華人民共和國藥典》，中藥復方包括黃芪30 g，升麻6 g，柴胡6 g，邊條參10 g，炙甘草15 g，當歸6 g，橘皮6 g，白術10 g。所有藥材均購自廣州市藥材市場，經鑒定為正品。生藥加適量水浸泡0.5～1.0 h，煎煮2次（1.5、1.0 h），合并濾液，然后將藥物濃縮至生藥1 g/ml，4℃保存以備用。

1.3實驗分組及處理[6]

雄性昆明小鼠40只隨機分為對照組和試驗組，每組20只。對照組和試驗組均給與抗真菌藥物灌胃治療[伊曲康唑口服液（西安楊森），50 mg/kg，q12 h，稀釋成1 ml溶液]。試驗組同時給予補中益氣湯4 g/（kg·d）灌胃。對照組給予等量生理鹽水灌胃。取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm腎組織勻漿，沙保弱培養基37℃培養48 h，進行白念珠菌菌落計數。動物模型建立后第7天處死實驗動物。組織標本采集后儲存于-80℃冰箱中。

1.4觀察指標及檢測方法

實驗第7天記錄兩組生存例數，計算生存率。RT-PCR檢測PGC-1α mRNA表達豐度。ELASA（南京建成生物工程研究所）檢測氮化應激指標（NO、總NOS、iNOS）。取肝臟組織0.2 cm×0.2 cm×0.3 cm，固定后切片，光鏡觀察肝臟形態學變化。

1.5統計學方法

采用SPSS 21.0進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組小鼠生存率的比較

試驗組第7天小鼠生存率為70%，顯著高于對照組的30%，差異有統計學意義（P=0.011）。

2.2兩組小鼠PGC-1α和氮化應激指標的比較

試驗組小鼠PGC-1α mRNA顯著高于對照組（P<0.05）；試驗組小鼠氮化應激指標顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組小鼠光鏡病理的比較

對照組小鼠光鏡下可見肝竇充血、細胞腫脹、部分呈空泡樣改變，局部可見少量白細胞移行。試驗組肝竇充血、細胞腫脹較對照組減輕，空泡樣改變較對照組減輕（圖1）。

3討論

近年來，念珠菌感染已占院內感染的13.2%，越來越受到臨床重視[7]。本研究前期研究顯示，免疫功能低下參與念珠菌感染的發生和發展，提高免疫功能可以改善念珠菌感染小鼠7 d生存率。免疫防御是西醫范疇中對機體抵抗微生物侵襲這一重要生理功能的描述。在中醫范疇中，將這一生理功能表述為正氣防御外邪。衛氣是肺、脾、腎功能協調旺盛的結果，可以發揮正氣防御外邪的作用。中醫學認為，衛氣與腎、脾、肺有關，關鍵又在于脾[8]。

中醫學認為，中醫脾與淋巴免疫功能密切相關[9]?！镀⑽刚摗分赋觥皟葌⑽福俨∮缮?。脾不僅主運化水谷精微，為后天之本，且能行使防御機能[1]。念珠菌感染多因年老、久病、長期臥床、外傷等原因致肺脾虧虛，痰濕、痰熱等外邪乖虛而入，肺失宣降、脾失健運發所致[2]。故念珠菌感染病機特點為本虛標實，邪盛正衰。補中益氣湯為宋代李杲《內外傷辨惑論》之方劑，具有補中益氣、升陽舉陷之功，是臨床上治療脾虛證的經典方劑。研究表明，補中益氣湯可提高脾氣虛動物模型免疫器官指數，有助于提高免疫功能[3]。

念珠菌感染容易并發多器官功能不全綜合征，其中肝臟是重要的靶器官[10]。線粒體結構和功能的改變參與了膿毒癥發生、發展的過程[11]。膿毒癥早期，肝細胞線粒體即可出現結構和功能改變，是膿毒癥發展的重要啟動環節；膿毒癥恢復期，線粒體損傷伴隨著新的線粒體蛋白的生成，是參與膿毒癥機體修復過程的重要表現[12]。

目前針對補中益氣湯治療脾虛動物模型的研究僅限于T淋巴細胞增殖能力和脾淋巴細胞抗氧化損傷[13]。本研究前期研究證實，免疫調節劑減輕念珠菌感染所致肝損傷與保持肝臟線粒體的完整性有關，但補中益氣湯對念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護機制未明[14]。本研究中，試驗組PGC-1α mRNA顯著高于對照組，提示補中益氣湯可以通過促進念珠菌感染動物模型肝細胞線粒體生成發揮對肝細胞線粒體的保護作用。既往研究證實，蛋白酶抑制劑可以提高PGC-1α水平，并且呈劑量依賴性，提示肝細胞線粒體生物發生參與了念珠菌感染病理損害的過程。

線粒體結構和功能損傷是膿毒癥器官功能損害的重要機制，大量動物研究結果顯示細胞因子的級聯反應是線粒體結構和功能損傷的主要原因之一[15-16]。細胞因子風暴包括氧化應激和氮化應激。近來多項基礎研究顯示氮化應激參與了膿毒癥線粒體結構和功能損傷的全過程[17-18]。本研究中，試驗組氮化應激指標顯著低于對照組，提示補中益氣湯可以通過抑制氮化應激水平促進念珠菌感染動物模型肝細胞線粒體生物發生，降低氮化應激程度與肝細胞保護作用相關。補中益氣湯與氮化應激、肝細胞線粒體生物發生之間的量效關系尚待進一步的探索研究。

[參考文獻]

[1]朱丹婷，李景，俞立英.白色念珠菌致病性研究進展[J].中國真菌學雜志，2015，10（1）：54-58.

[2]楊璐，馮文莉.光動力療法抗白色念珠菌感染的研究進展[J].中華臨床醫師雜志（電子版），2016，10（20）：3107-3111.endprint

[3]羅晶，顧紅纓，徐國憲.補中益氣湯對脾虛小鼠免疫功能的調節[J].中國現代醫學雜志，2006，16（17）：2613-2615.

[4]邢文婷，張李峰，程衛東，等.含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清對老齡小鼠脾淋巴細胞抗氧化損傷作用的比較[J].中藥材，2014，37（2）：299-302.

[5]劉春英，胡小萍，趙金茹，等.補中益氣湯對感染白色念珠菌小鼠免疫功能調節作用的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，1997，3（2）：19-20.

[6]李小悅，黃順偉，江智毅，等.烏司他丁對侵襲性念珠菌感染小鼠肝臟的保護作用及機制研究[J].中國急救醫學，2013， 33（10）942-944.

[7]李小悅.烏司他丁對侵襲性念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護作用[J].中國當代醫藥，2016，23（15）：106-108.

[8]李小悅，黃順偉，陳娟，等.烏司他丁聯合抗真菌藥物治療侵襲性念珠菌感染的實驗研究[J].中華普通外科學文獻（電子版），2013，7（4）：21-24.

[9]Pfaller MA，Diekema DJ.Epidemiology of invasive candidiasis：a persistent public health problem[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：133-163.

[10]阿米娜·阿不拉，斯拉甫·艾白，古力娜·達吾提，等.鞣花酸體外抗真菌活性及對小鼠白色念珠菌感染模型的治療作用研究[J].中國藥理學通報，2016，32（3）：399-403.

[11]羅晶，顧紅纓，徐國憲.補中益氣湯對脾虛小鼠免疫功能的調節[J].中國現代醫學雜志，2006，16（17）： 2613-2615.

[12]Singer M.Mitochondrial function in sepsis：acute phase versus multiple organ failure[J].Crit Care Med，2007，35（Supple）：S441-S448.

[13]Benton CR，Han XX，Febbraio M，et al.Inverse relationship between PGC-1 alpha protein expression and triacylglycerol accumulation in rodent skeletal muscle[J].J Appl Physiol，2006，101（2）：388-382.

[14]尹剛，王志強，肖莉.感染性休克肝細胞線粒體損傷機制的實驗研究[J].中國急救醫學，2003，23（10）：692-693.

[15]呂杰，楊勁松，李童，等.血必凈注射液對膿毒性休克大鼠器官微觀結構的影響[J].中國中西醫結合急救雜志，2015，22（1）：46-50.

[16]Sato K，Miyakawa K，Takeya M，et al.Immunohistochemical expression of inducible nitric oxide syntheses（iNOS）in reversible endotoxic shock studied by a novel monoclonal antibody against rat iNOS[J].J Leukoc Biol，1995，57（1）：36-44.

[17]錢建輝， 劉江偉， 李瑞，等.沙漠干熱環境下創傷失血性休克大鼠肝臟組織形態學和肝臟功能的變化特點[J].中國急救醫學，2014，34（7）：644-647.

[18]Bruins MJ，Lamers WH，Meijer AJ，et al.In vivo measurement of nitric oxide production in porcine gut，liver and muscle during hyperdynamic endotoxaemia[J].Br J Pharmacol，2002，137（8）：1225-1236.

（收稿日期：2017-11-02 本文編輯：崔建中）endprint