氮磷添加對杉木林土壤碳氮礦化速率及酶動力學特征的影響

聶二旗,張心昱,鄭國砥,楊 洋,王輝民,陳伏生,孫曉敏

1 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室,北京 100101 2 中國科學院地理科學與資源研究所環境修復中心,北京 100101 3 中國科學院大學,北京 100049 4 江西農業大學江西省竹子種質資源與利用重點實驗室,南昌 330045

在亞熱帶森林生態系統中,氮(N)、磷(P)有效性限制著森林初級生產力和生態系統穩定性[1]。然而,最近半個世紀由于人類活動等因素的影響,大氣N沉降逐漸增加,導致亞熱帶土壤中N素有效性增加,N/P比失衡,P素相對更加缺乏[2]。養分有效性的增加會影響微生物對養分的需求,改變微生物對有機質的分解,影響土壤中的碳儲存[3]。土壤C、N礦化將土壤中有機質分解成CO2和無機氮,并且對森林生態系統CO2排放和N養分供應中起著重要的作用[4]。盡管N添加對于C、N礦化影響的研究較多[5-6],而結論還不一致,有促進[5,7],抑制[5,8],無影響[9]。P素作為亞熱帶森林生態系統主要的限制因子,在C、N循環的過程中起著重要的調控作用[10],而目前關于外源P素輸入對C、N礦化的影響還鮮見報道[5]。

土壤微生物是有機質中C、N礦化的主要驅動者[11],能夠產生胞外酶催化土壤中有機質的分解,其水解酶活性能夠反應微生物對于能量和養分的需求[12-13]。其中,β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)能夠分解纖維素二糖為葡萄糖,是表征土壤碳礦化的重要微生物指標。β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)能夠降解幾丁質和肽聚糖,將殼二糖水解為氨基葡萄糖,是表征土壤碳、氮礦化的重要微生物指標[14]。N、P添加通過調節微生物的底物有效性,進而影響微生物分泌酶的活性,目前研究發現N、P添加對土壤βG、NAG潛在最大酶活性(Vmax)的影響有促進、抑制、無影響[15-16],但潛在最大酶活性是飽和底物濃度下酶活性[17],未反映土壤中底物濃度對酶活性的影響。酶動力學特征一般遵循米氏方程,可以反映不同底物濃度下的酶活性,完整的描述酶的催化進程[18]。米氏方程中的半飽和常數(Km)是反應速率為酶最大反應速率一半時的底物濃度,與酶的本質屬性有關,是表征酶與底物親和力的常數,其值越小,酶與底物的親和力越強,即酶-底物復合體的形成能力越強[19],酶動力學參數Vmax/Km可反映酶的催化效率[18]。所以開展N、P添加對土壤βG、NAG的動力學參數的影響具有重要的意義。

本文選擇亞熱帶杉木人工林,開展野外長期N、P添加控制試驗,分析N、P添加對杉木林土壤C、N礦化、βG和NAG動力學特征參數的影響,并分析土壤養分與土壤C、N礦化速率、酶動力學特征參數的關系,以期為未來氮沉降增加背景下亞熱帶森林土壤C、N礦化研究提供數據依據。

1 研究區域概況

1.1 研究區概述

試驗樣地位于江西省泰和縣中國科學院千煙洲石溪林場 (26°44′52″N,115°04′13″E),該區地處亞熱帶季風氣候區,雨量充沛,四季分明,海拔102m,年平均氣溫17.9℃,年平均無霜期280d,年平均降雨量1471mm,是典型的紅壤丘陵地貌,成土母質多為紅色砂巖、砂礫巖或泥巖以及河流沖積物,地處中亞熱帶常綠闊葉林區,由于原有植被被破壞,現多為人工林,森林覆蓋近70%,主要樹種為1985年前后種植的馬尾松(Pinusmassoniana) 、濕地松(PinuselliottiiEngelem) 和杉木(Cunninghamialanceolate)[20- 21]。

1.2 試驗設計

杉木人工林N、P添加控制試驗共4個處理,對照(CK)、N(50 kg N hm-2a-1)、P(50 kg P hm-2a-1)、NP(50 kg N hm-2a-1+50 kg P hm-2a-1)氮肥為NH4NO3,磷肥為NaH2PO4。每個處理5次重復(n=5),各小區面積400m2(20m×20m),共20個小區,按隨機區組設計小區間隔>10 m,各小區隨機排列,其中每個小區中劃分4個亞小區,允許土壤破壞性采樣的面積為10m×10m,其他區域為永久觀測區。自2012年開始施肥,每年4次,分別為3、6、9和12月,其中生長季6月和9月施肥量均為全年的30%,非生長季3月和12月施肥量均為全年的20%。本研究選擇2014年11月采樣,在每個允許土壤破壞性采樣的亞小區中隨機選取5點,除去地表凋落物層后,用直徑2cm的土鉆采集0—10cm土壤樣品,過2mm篩,挑除根系后,自封袋密封保存,冷藏箱運回實驗室,在4℃冰箱冷藏備用。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤碳、氮礦化速率

釆用室內需氧連續培養法[22],測定有機碳、氮礦化速率。培養前根據測定的土壤含水量,經過含水率公式換算后,再取相當于40g干土重的新鮮土樣于150mL塑料瓶中,瓶蓋上有3個直徑約為2mm的透氣小孔。將樣品在25℃恒溫培養箱中培養,每天進行稱重補充水分,保持土壤含水量不變。在培養的第14天,進行土壤碳、氮礦化速率的測定。

采用自主研發裝置測定碳礦化速率,該裝置主要由Li-COR(Li- 7000) CO2紅外濃度分析儀、數據采集器、低溫循環儀、恒溫水浴鍋和電磁閥等組成。試驗測定中系統可根據實驗需求調節裝置內起始CO2濃度、測試時間并能自動轉換測定樣品[23],土壤碳礦化速率計算公式如下：

式中:Cmin為土壤碳礦化速率(μg C g-1d-1)；C為測試時間內CO2濃度變化的直線斜率；V為包括培養瓶和管線等所有氣體體積；m為培養瓶內土壤轉化為干土質量；α為CO2氣體體積轉化為質量的系數；β為時間(s)轉化為天數的系數。

稱取培養前后1g土樣,測定土壤銨態氮、硝態氮含量,進行氮礦化速率的計算[24]

R銨=(NB銨-NA銨)/d

R硝=(NB硝-NA硝)/d

Nmin=(NB銨+NB硝-NA銨-NA硝)/d

式中：NB銨為培養后銨態氮量；NB硝為培養后硝態氮量；NA銨為培養前銨態氮量；NA硝為培養前硝態氮量；Nmin為土壤凈氮礦化速率；R銨為土壤氨化速率；R硝為土壤硝化速率；d為培養時間。

1.3.2 酶反應動力學參數

土壤βG和NAG活性分析采用微孔板熒光法(Saiya-Cork, 2002),分別利用4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucopyranoside)和4-甲基傘形酮- 2-乙酰氨基- 2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUB-N-acetyl-b-D-glucopyranoside)做βG和NAG的底物,應用多功能酶標儀(SynergyH4, BioTek)在365nm熒光處激發,450nm處進行熒光檢測。βG和NAG底物均設置8個濃度梯度(5、10、20、30、40、60、100、200μmol/L),并設置8個重復,避光條件下,恒溫培養箱中培養4h后進行測定。

將測定的酶活性和底物濃度利用SigmaPlot10軟件進行米氏方程曲線擬合,求出最大酶促反應速率(Vmax)和半飽和常數(Km)：

V=Vmax[S]/ (Km+[S])

式中,V為酶促反應速率,Vmax為最大酶促反應速率,S為底物濃度,Km為半飽和常數,即酶促反應速率達到1/2Vmax時的底物濃度,可用來表示酶與底物的結合程度。

1.3.3 土壤理化性質

1.4 數據分析

采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較對各指標進行顯著性檢驗,顯著性水平P<0.05；采用主成分分析(PCA)方法評價不同處理對土壤性質、Cmin和Nmin、βG和NAG動力學參數的影響；利用Pearson檢測Cmin、Nmin和βG和NAG動力學參數及土壤環境因子之間的相關性。用SPSS 19.0進行統計分析,Sigma Plot 10.0制圖。

2 結果與分析

2.1 氮磷添加對土壤理化性質的影響

表1 氮、磷添加對土壤理化性質影響

每列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05,n=5),數據表示平均值(標準誤差);N (50kg N hm-2a-1), P (50kg P hm-2a-1), NP (50kg N hm-2a-1+ 50kg P hm-2a-1)

2.2 氮磷添加對土壤碳氮礦化速率的影響

N比CK的Cmin低25%(P<0.05),P、NP對Cmin的影響較CK均不顯著；N添加顯著的抑制了Nmin(P<0.05),N、NP主要通過抑制R銨使土壤Nmin較CK分別降低了18%和8%,其中,NP較CK 使Nmin減小達到顯著水平(P<0.05)(圖1)。

2.3 氮磷添加對土壤酶動力學的影響

土壤βG和NAG的活性與底物濃度的擬合均遵循米氏方程(圖2)。N添加使βG的酶動力學參數Vmax、Km較CK(66nmol h-1g-1、53μmol/L)增加了36%、13%(P<0.05),但對酶的Vmax/Km影響不明顯(P>0.05)。P輸入(P、NP)降低了NAG的Vmax、Km,比CK降低了26%—60%(P<0.05)。NP同時添加使βG和NAG的Vmax/Km值分別較CK增加了61%、89%(P<0.05)(表2)。βG和NAG的動力學參數Vmax與Km之間均顯著正相關(P<0.05)(圖3)。

圖1 氮磷添加對土壤碳氮礦化速率的影響Fig.1 The effects of nitrogen and phosphorus additions on the rates of soil carbon and nitrogen mineralization

圖2 氮磷添加條件下β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)米氏方程擬合結果Fig.2 Michaelis-Menten equation of β-glucosidase (βG) and N-acetyl-glucosaminidase (NAG) under N and P additions

處理TreatmentVmax/(nmolh-1g-1)Km/(μmol/L)Vmax/Km/h-1βGNAGβGNAGβGNAGCK66±11b34±0a53±12b38±3a1．3±0．13b0．9±0．06bN89±3a27±2b85±7a38±1a1．0±0．05b0．8±0．15bP74±4ab25±1b58±8b24±3b1．3±0．09b1．1±0．09bNP59±4b25±1b27±2c15±1b2．1±0．17a1．7±0．13a

每列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05,n=3),數據表示平均值±標準誤差;Vmax：最大酶促反應速率,Maximum rate of enzyme reaction;Km：半飽和常數,Michalis constant;Vmax/Km：酶促反應效率,The efficiency of enzyme reaction；βG：β-1,4-葡萄糖苷酶,β-glucosidase；NAG：β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶,N-acetyl-glucosaminidase

圖3 土壤β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)動力學參數Vmax、Km的相關性分析Fig.3 Relationships between the kinetics parameters (Vmax and Km) of β-glucosidase (βG) and N-acetyl-glucosaminidase (NAG)

2.4 主成分分析

2.5 相關分析

圖4 土壤碳氮礦化速率、土壤βG、NAG動力學參數和土壤環境因子主成分分析Fig.4 Principal component analysis of the soil carbon and nitrogen mineralization rates, βG and NAG kinetic parameters and soil environment factors(a)不同處理得分,(a) score of different treatment；(b)土壤Cmin、土壤Nmin、土壤βG、NAG動力學參數和環境因子載荷值,(b) loading values of individual soil carbon and nitrogen mineralization rate, βG kinetics and soil environmental factors；βGVmax：βG酶促反應最大速率, Maximum rate of β-glucosidase；βGKm：βG米氏常數,Michalis constant of β-glucosidase； NAG Vmax：NAG酶促反應最大速率,Maximum rate of N-acetyl-glucosaminidase；NAGKm：NAG米氏常數, Michalis constant of N-acetyl-glucosaminidase；Ka (βG): 土壤βG的催化效率Vmax/Km, efficient reaction of N-acetyl-glucosaminidase; Ka (NAG): 土壤NAG的催化效率Vmax/Km,The efficient reaction of N-acetyl-glucosaminidase

礦化MineralizationpHpH有機碳SOC全氮TN全磷TP可溶性碳DOC銨態氮NH+4-N硝態氮NO-3-N有效磷aP碳礦化速率Cmin0．262-0．2390．1380．0470．551?-0．189-0．01-0．187氮礦化速率Nmin0．635??-0．3720．1530．3670．215-0．459?-0．581?0．204氨化速率R氨0．530?-0．616?-0．456-0．161-0．045-0．329-0．421-0．187硝化速率R硝0．0500．2980．2920．639?-0．1050．166-0．1640．654?

*P<0.05,**P<0.01,n=20；Cmin：碳礦化速率,Carbon mineralization；Nmin：氮礦化速率,Nitrogen mineralization；R氨：氨化速率,Ammonification rate；R硝：硝化速率,Nitrifying rate

表4 βG、NAG動力學參數與土壤環境因子的相關性

*P<0.05,**P<0.01,n=12

3 討論

3.1 氮磷添加對土壤碳、氮礦化速率的影響

Cmin隨著培養時間的延長而降低,與Fang等[26]的研究結果一致,這是由于培養后期土壤中易分解的糖類和蛋白質等物質減少,難分解的木質素、纖維素逐漸占主導地位,導致微生物對有機碳的利用效率降低[26]。本文表明N添加抑制土壤Cmin,這與Jussy等[7]的結果一致。N添加減少了杉木林中土壤微生物量及微生物群落的多樣性[27],導致土壤Cmin降低。文中P添加對土壤Cmin沒有明顯影響,主要因為在P素限制的亞熱帶森林地區,外源P素輸入主要被植物吸收[28],對與Cmin有關的微生物影響較小。

3.2 氮磷添加對土壤水解酶動力學特征的影響

文中結果顯示,N添加增加了βG的Vmax,這與Stone等[31]的結論一致。N添加增加了土壤中氮素的有效性,導致碳素相對缺乏。根據微生物經濟分配理論,此時微生物會產生更多與碳分解的酶,即增大碳水解酶的Vmax[31]。有研究結果表明Vmax、Km是米氏方程中兩個獨立的變量[16],本文研究結果也表明,N添加使βG的Vmax和Km同時增大(圖3),其原因可能是酶與有機物結合的有效位點受有機物有效性的限制,而輸入的氮素會與土壤中的含碳化合物形成復雜的有機體[32],降低了βG與底物的親和力,增加了土壤βG的Km[30]。本文結果表明,N添加并未增加βG的Vmax/Km(催化效率)(表2),說明N添加條件下,土壤微生物不是通過提高酶的Vmax/Km,而是通過提高酶的Vmax[31]來緩解由于N添加引起的碳限制。另外文中結果表明,N添加條件下的Cmin與βG的Vmax成反比,這是因為Cmin、Nmin大小不但受Vmax的影響,還與酶與底物的親和力常數Km有關,Cmin、Nmin的大小Vmax/Km決定[18]。

P添加抑制了NAG的Vmax(表2),這與Wang等[33]的研究結果一致,原因可能是在較高的aP條件下微生物減少了NAG數量的產生[33]。也有研究認為,aP可以緩解微生物對N素的需求,從而降低了氮水解酶的活性[34]。P添加對βG的Vmax無明顯影響,這盡管與微生物經濟分配理論不一致,但也和一些研究報道一致,例如Turner等[13]在亞熱帶的森林研究中發現持續10年的P添加對βG的Vmax無明顯影響。然而,文中結果顯示,NP同時添加明顯的增加βG和NAG的Vmax/Km(表2),這可能與NP同時添加降低了這兩種酶的Km,增加了酶與底物的親和力有關(表2)。

4 結論

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