金蓮花多苷片中四種黃酮類化合物的含量測定

南敏倫 王蓮萍 張家賀 趙昱瑋 司學(xué)玲 胡 銘 赫玉芳,4▲

1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春 130012；2.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林長春130012；3.吉林吉春制藥股份有限公司，吉林四平 136100；4.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春 130117

金蓮花多苷片是以金蓮花（Trollius chinensis Bunge.）為原料經(jīng)過乙醇提取、大孔樹脂純化等手段得到的藥物制劑。主要活性成分為黃酮類化合物[1-2]，含有的黃酮類成分主要含有三種碳苷黃酮（葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷）及槲皮素[3-6]。具有活血化瘀，宣通血脈的功效。用于氣虛血瘀所致胸痹，表現(xiàn)為胸悶，刺痛或隱痛，心悸氣短，神疲乏力，頭暈?zāi)垦５劝Y。本研究采用HPLC法，測定金蓮花多苷片中黃酮類成分的含量，從而控制金蓮花多苷片的質(zhì)量。

1 儀器試劑與藥品

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國安捷倫），紫外檢測器（VWD），自動進(jìn)樣；BS124S型分析天平（賽多利斯）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

牡荊苷、葒草苷、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111777-201201；111687-201502、100081-200801）、葒草素 -2"-O-β-L- 半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（自制，純度為99.8%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，純凈水（娃哈哈）。

金蓮花多苷片樣品，由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACE C185μm 250 mm×4.6mm色譜柱；檢測波長為360nm，流速：1.0mL/min，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：10μL，流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫，梯度洗脫：0～10min，15% ～ 20% A；10 ～ 20min，20% ～ 35% A；20～30min，35%～45% A。按葒草苷峰計理論板數(shù)應(yīng)不低于5000。按外標(biāo)法計算。對照品及供試品溶液色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，槲皮素、牡荊苷、葒草苷及葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷各峰分離度均達(dá)到要求[6-9]。

圖1 三種對照品（a）及樣品（b）高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷及槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1mL含葒草素-2”-O-β-L-半乳糖苷0.10mg、葒草苷0.05mg、牡荊苷0.03mg、槲皮素0.03mg的對照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取金蓮花多苷片20片，研細(xì)，取20mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲提取處理30min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷對照品9.88mg，葒草苷對照品5.05mg、牡荊苷對照品3.02mg、槲皮素對照品3.04mg，置同一25mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，精密量取2.5mL，置同一10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，即得。分別吸取對照品溶液 2、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，分別以葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷及槲皮素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算回歸方程。葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷的回歸方程分別為Y=1493.25 X+13.66，r=0.9999，線性范圍為 0.1976～ 1.9760 μg；葒草苷的回歸方程為Y=1519.70X-4.15，r=0.9999，線 性 范 圍 為 0.1010～ 1.0100μg；牡荊苷的回歸方程為Y=2123.12X+3.17，r=0.9997，線性范圍為0.0604～0.6040μg；槲皮素的回歸方程為Y=3016.69X+0.24，r=0.9999，線性范圍為0.0608～0.6080μg。表明四種對照品在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 中間精密度試驗

取同一批金蓮花多苷片樣品（批號160501），在不同時間、不同人員、兩臺不同液相色譜儀按照2.3的制備方法制備供試品溶液，按照2.1色譜條件進(jìn)行分析，記錄四種測定成分的峰面積，從而計算得到葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷及槲皮素含量的 RSD（n=6）分別為1.25%、1.18%、1.21%、0.99%。說明了該方法中間精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取金蓮花多苷片樣品（批號160501），制備得到供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12，24h 按照 2.1 色譜條件進(jìn)樣測定，記錄四種成分的峰面積，實驗結(jié)果顯示，葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷及槲皮素峰面積的RSD（n=6）分別為1.05%、1.20%、1.05%、0.89%，說明了供試品穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批金蓮花多苷片樣品（批號160501）6份，按2.3制備方法制備供試品溶液，按照2.1色譜條件進(jìn)樣分析，計算四種成分的含量，實驗結(jié)果顯示，葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷及槲皮素含量的RSD（n=6）分別為0.85%、0.89%、1.05%、1.02%，表明該法重復(fù)性良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗

取已知含量的金蓮花多苷片樣品（批號160501）6份各約10mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，分別精密加入四種測定成分的對照品，按供試品制備方法制備，按色譜條件測定，進(jìn)行加樣回收率考察，結(jié)果三種碳苷黃酮及槲皮素的平均回收率結(jié)果見表1。

表1 四種黃酮類成分的平均回收率結(jié)果（n=6）

表2 金蓮花多苷片四種黃酮類成分含量測得結(jié)果（n=3）

2.9 樣品分析

取三批金蓮花多苷片，制備得到供試品溶液，進(jìn)行含量測定，測定四種黃酮類成分的含量，每個供試品測定3次，按2.1項下進(jìn)行高效液相色譜分析，計算四種黃酮類成分的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

金蓮花多苷片以黃酮為有效部位的中藥5類新藥，對由于心肌缺血造成的胸悶，刺痛、隱痛，心悸氣短，神疲乏力等癥具有很好的治療作用。本研究對主要的黃酮類成分牡荊苷、葒草苷、葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷及槲皮素進(jìn)行含量測定研究，確定了含量測定方法，為控制金蓮花多苷片的質(zhì)量提供了方法參考[6，9]。

以往研究表明，金蓮花主要活性成分是以葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷及牡荊苷為主的碳苷黃酮[10-14]，本實驗結(jié)果表明，除以上三種碳苷黃酮外，富集以后的總黃酮，槲皮素也是主要活性成分。南敏倫曾對金蓮花中的三種碳苷黃酮進(jìn)行了含量測定[15]，李桂蘭曾對金蓮花中的葒草苷、牡荊苷及槲皮素進(jìn)行了含量測定[5]，本研究對由總黃酮制成的制劑中的四種成分進(jìn)行了含量，與文獻(xiàn)報道的含有的主要黃酮類成分一致。也為金蓮花的藥材的質(zhì)量控制提供參考。

槲皮素屬于弱極性物質(zhì)，而葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷屬于極性較強(qiáng)的化合物，等梯度洗脫時間較長，經(jīng)過試驗摸索，確定了本文的梯度洗脫條件[5-6]，在實驗摸索階段，曾利用（乙腈-水）、（甲醇-水）、（甲醇-磷酸水）（甲醇-醋酸水）系統(tǒng)進(jìn)行實驗，經(jīng)過耐用性考察，確定本文的實驗條件為最佳實驗條件。在檢測波長的考察中，利用345nm與360nm分別進(jìn)行實驗，實驗結(jié)果表明，兩者分離測定結(jié)果基本一致，但是345nm分離效果較差，故選擇345nm。

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