星點設計-效應面法優化知母鹽制的炮制工藝

王曉婷 閆 麗 孫冬月 王馨雅 高 慧

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge）的干燥根莖，始載于《神農本草經》，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內熱消渴，腸燥便秘等癥[1]。鹽炙知母最早見于宋代的《扁鵲心書》，鹽炙法是歷史上知母的主流炮制方法，鹽知母為歷版《中國藥典》收載的知母飲片的唯一炮炙品種。傳統理論認為知母鹽炙后能夠“引藥入腎經，增強滋陰降火的作用”[2-4]。

在前期的實驗研究中，我們多次證明了知母鹽制后降糖效果顯著增強[5-7]。知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷均具有降血糖活性，且為炮制后增量，是鹽知母降血糖作用增強的物質基礎。在鹽知母降血糖作用增強未知的情況下，我們以當時2005、2010版《中國藥典》知母含量測定項下的菝葜皂苷元、芒果苷含量為指標進行了鹽知母炮制工藝的研究[8]。隨著研究的深入，降血糖作用物質基礎的揭示，有必要以降血糖有效成分為指標對炮制工藝進行優選，并對工藝優化后的鹽知母降血糖作用進行再評價，為鹽知母飲片的炮制提供規范的工藝參數，為生產質優效確的飲片提供技術支持。

現版《中國藥典》鹽知母的質量標準中的含量測定項，為測定芒果苷、知母皂苷Ⅱ的含量，其中對鹽知母中兩種成分含量的規定均低于生知母飲片。我們研究表明知母鹽炙后芒果苷、知母皂苷Ⅱ的含量均增加，可見藥典中質量標準缺乏真正控制鹽知母質量的有效性。另外，知母皂苷Ⅱ是炮制過程的中間產物，在鹽炙過程中會進一步水解成降血糖的活性成分知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ，所以將知母皂苷Ⅱ作為含量測定指標亦不夠科學。所以本課題以優化后的鹽炙工藝自行炮制鹽知母樣品，以知母炮制后的增量成分知母皂苷A III、知母皂苷B III、芒果苷為含量測定指標[9]，建立鹽知母質量評價的含量測定標準。以彌補《中國藥典》鹽知母飲片含量測定指標的不足，為藥典再版時制訂針對鹽知母質量的真正能有效控制鹽知母的質量標準提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

LC-20AB高效液相色譜儀（日本島津公司）；Corona電霧式檢測器（美國ESA公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；十萬分之一分析天平（瑞士METTLER公司）；電子天平（上海精密科學儀儀器有限公司）；Waters高效液相色譜儀（waters e2695、Waters2998PDA、自動進樣裝置）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要材料及試劑

知母飲片購于四川新荷花片飲股份有限公司（1405127），知母藥材采自河北省易縣西陵鎮太和莊、龍泉莊，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為百合科知母屬植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.干燥根莖。知母皂苷AⅢ對照品（純度≥98%，批號MUST-13042609）、知母皂苷BⅢ對照品（純度≥98%，批號MUST-13121110）均購自成都曼思特生物科技有限公司，芒果苷對照品（純度≥98%，批號111607-200402）購自中國藥品食品生物制品檢定所。甲醇、乙腈為色譜純，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 知母皂苷類含量測定

2.1.1 色譜條件 Thermo C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）； 流動相為水 -乙腈 ，流速為 1mL/min；進樣量：20μL，柱溫：30℃，Corona參數：氮氣壓力35psi（241.3kPa），filter：High，Range：200pA； 梯度洗脫程序見表1。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，測定。對照品、知母樣品的色譜分離圖見圖1。結果表明，保留時間適中，供試品色譜峰的保留時間和峰形與對照品均一致，供試品中知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ與其它相鄰色譜峰的分離度良好，對照品、供試品的理論塔板數不少于5000。說明該分析條件良好，符合定量分析要求。

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ對照品適量，甲醇溶解，作為對照品儲備液。精密量取各儲備液適量，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ質量濃度分別為0.273mg/mL，0.265mg/mL的混合對照品溶液。

表1 梯度洗脫條件

圖1 知母皂苷類對照品及知母樣品HPLC圖

2.1.3 供試品溶液制備 取鹽知母粉末（過三號篩）1.0g，精密稱定，用約8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1h，濾過，合并濾液，得醇浸膏。浸膏以100mL甲醇分散濾過，即得。

2.1.4 方法學考察 （1）線性范圍考察：分別精密吸取對照品儲備溶液 1、4、8、10mL 置 25mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進樣20μL，以進樣濃度為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），分別繪制標準曲線。知母皂苷AIII回 歸 方 程 為 Y=282360.784X+1712592，r=0.9997；知母皂苷BIII回歸方程為：Y=1995356.06 X-3190777，r=0.9995。結果表明知母皂苷A-Ⅲ在 0.2184～ 2.184μg、知母皂苷 B-Ⅲ在0.212～2.12μg范圍內呈良好線性關系。（2）精密度試驗：分別精密吸取上述配制的知母皂苷AIII、知母皂苷BIII對照品溶液，連續進樣6次，每次均20μL，按前述色譜條件，測定色譜峰面積，結果知母皂苷AIII、知母皂苷BIII峰面積RSD分別為1.69%、1.33%。測定結果表明，儀器精密度良好。（3）穩定性試驗：精密吸取同一份供試品溶液，按上述色譜條件分別于 0、2、4、6、8、12、24h 進樣 20μL，測定色譜峰面積，結果知母皂苷AIII、知母皂苷BIII的RSD分別為1.53%、1.64%，表明供試品溶液在制備后24h內色譜峰面積無明顯變化，穩定性良好。（4）重復性試驗：取鹽知母樣品6份，按供試品項下制備供試品溶液，分別精密吸取20μL按擬定色譜條件進行測定，計算含量。結果樣品中知母皂苷AIII、知母皂苷BIII含量的RSD 分別為1.42%和1.22%，表明方法重復性好。（5）加樣回收率：精密稱定已知知母皂苷AIII、知母皂苷BIII含量的知母飲片6份，每份0.25 g，置50mL量瓶中，分別精密加入知母皂苷AIII對照品溶液（0.273mg/mL）20 mL、知母皂苷BIII對照品溶液（0.265mg/mL）20mL，按供試品制備制成樣品，以上述色譜條件進行測定，計算加樣回收率，知母皂苷AIII、知母皂苷BIII加樣回收率分別為99.98%、99.65%，RSD值為1.2%、0.79%，符合規定。2.1.5 樣品含量測定 按上述方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件，每次進樣20μL，測定峰面積，采用外標一點法計算知母皂苷AIII、知母皂苷BIII的含量。

2.2 知母中芒果苷含量測定

2.2.1 色譜條件 Ecosil色譜柱（4.6mm×150mm，5μm），流動相乙腈（A）-0.2% 冰醋酸（B），梯度洗脫（0～ 10min，10%A；10～ 25min，15%A），體積流量1.0mL/min，檢測波長258nm，進樣量10μL。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，測定。對照品、知母樣品的色譜分離見圖2。結果表明，保留時間適中，供試品色譜峰的保留時間和峰形與對照品均一致，供試品中芒果苷與其它相鄰色譜峰的分離度良好，對照品、供試品的理論塔板數不少于5000。說明該分析條件良好，符合定量分析要求。

圖2 芒果苷與知母供試品的色譜圖

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取芒果苷對照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，得芒果苷質量濃度為0.8065 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取鹽知母粉末（過三號篩）0.1g，精密稱定，至于25mL具塞錐形瓶中，加稀乙醇約25mL，稱重，超聲提取（功率40W，頻率100Hz）放冷后，補足失重，即得。

2.2.4 方法學考察 （1）線性范圍考察：分別精密吸取對照品儲備溶液 1、4、8、10mL 置 25mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進樣20μL，以進樣濃度為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），分別繪制標準曲線。芒果苷回歸方程為：Y=150684X+20288，r=0.9991。結果表明芒果苷在0.6452～6.452μg范圍內呈良好線性關系。（2）精密度試驗：分別精密吸取上述配制的芒果苷對照品溶液，連續進樣6次，每次均20μL，按前述色譜條件，測定色譜峰面積，結果芒果苷峰面積RSD為1.47%。測定結果表明，儀器精密度良好。（3）穩定性試驗：精密吸取同一份供試品溶液，按上述色譜條件分別于 0、2、4、6、8、12、24h 進樣 20μL，測定色譜峰面積，結果芒果苷的RSD為1.61%，表明供試品溶液在制備后24 h內色譜峰面積無明顯變化，穩定性良好。（4）重復性試驗：取鹽知母樣品6份，按供試品項下制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL按擬定色譜條件進行測定，計算含量。結果樣品中芒果苷含量的RSD為1.42%和1.39%，表明方法重復性好。（5）加樣回收率：精密稱定已知芒果苷含量的知母飲片6份，每份0.5g，置100mL量瓶中，分別精密加入芒果苷對照品溶液（0.8065mg/mL）10 mL，配制成樣品，計算加樣回收率為99.82%，RSD值為0.85%，符合規定。

2.2.5 樣品含量測定 按上述方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件，每次進樣10μL，測定峰面積，采用外標一點法計算芒果苷的含量。

2.3 單因素考察

首先以“藥透湯盡”作為加水量、悶潤時間的判斷標準，確定加水量為30mL/100g、悶潤時間以藥透湯盡判斷，大約2～4h。然后根據經驗以加鹽量、炒制溫度、炒制時間為影響因素，進行單因素考察。

2.3.1 炒制時間的選擇 取知母10份，加鹽量為3g/100g，悶潤吸盡后，以150℃為炒制溫度，分別炒制 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18min，以“炒干”這一傳統判斷標準對不同的炒制時間進行評價，結果表明炒制10～12min時效果最好，“干而不糊”。

2.3.2 炒制溫度的選擇 取3份知母，加鹽量為3g/100g，悶潤吸盡后，分別以 120、150、180℃炒制，用鹽量為3g，炒制10min，以“炒干”這一傳統判斷標準對不同的炒制溫度進行評價，結果表明150℃效果最好。

表3 實驗設計及結果

2.3.3 加鹽量的選擇 取5份知母，加鹽量分別為 1g/100g、2g/100g、3g/100g、4g/100g、5g/100g，在150℃下炒制10min，通過外觀對不同用鹽量進行評價，各用鹽量之間無明顯差異。

2.4 星點實驗設計與效應面分析[10]

在單因素考察的基礎上，采用軟件Design-Expert 8.0.7.1中Central Composite試驗設計方法，結合經驗選取加鹽量（A）、炒炙時間（B）、炒炙溫度（C）為試驗的3個因素，5個水平分別以±1.732，±1，0進行編碼，見表2。制備樣品，以知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷總含量（mg/g）為效應值（Y）。采用Design-Expert 8.0.7.1軟件進行多元回歸擬合，判斷模型優劣，確定最佳工藝，并進行工藝驗證。每次稱取100g鹽知母，按表2試驗，并以HPLC-CAD法測定知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ的含量，以HPLC-PDA法測定芒果苷的含量。

表2 星點設計因素與水平表

3 結果

3.1 實驗設計及結果

根據文獻報道，在單因素考察基礎上，利用星點設計效應面法，對加鹽量、炒炙時間、炒炙溫度這3個影響顯著的考察因素進行優化設計。每個因素設計5個水平，分別用代碼值0，-1，1，-0.1732，0.1732表示，結果見表3，知母皂苷B-Ⅲ、知母皂苷A-Ⅲ、芒果苷的總含量為指標，用三因素五水平的星點設計效應面法優化鹽知母炮制工藝。結果表明，20組實驗所得出知母皂苷B-Ⅲ、知母皂苷A-Ⅲ、芒果苷的差異很大，其中知母皂苷A-Ⅲ的范圍是1.091%～3.483%，知母皂苷B-Ⅲ的范圍是0.883%～1.942%，芒果苷的范圍是0.598～1.024%。

3.2 模型擬合度

由試驗結果分析得出，運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件以總評OD值為因變量，對自變量進行分析，所得回歸方程為：Y=0.79-0.020A+0.041B+0.027C-0.047AB+0.06AC+0.00763BC-0.018A2-0.062B2-0.06C2（r=0.9193），相關系數r較大，表明模型具有較高的顯著性，可看出方程預測性和擬合度較好，可用此模型對知母鹽炙工藝進行預測分析。由方差分析表，可看出B加熱溫度對總評OD影響較為顯著。

3.3 效應面優化與預測性評價

根據回歸方程式，運用星點設計的相關軟件得到3D圖像，再由圖3得到最優區域，并篩選出最佳炮制工藝。由圖3可以得知，在A、B因素中，隨著因素B溫度的增加，而曲面變陡峭；而A鹽量的影響相對變小。而在A、C因素中，隨著A鹽量和C炒制時間的增加，曲面走向變得平緩；在B、C方面，隨著B溫度的增加，OD值也隨之增加，而使得曲面變陡，隨著C炒制時間的增加，使得OD值得變化變得平緩。由以上的分析可知，B炒制溫度對其影響較大，而B、C影響較小。采用軟件Design-Expert 8.0.7.1中Central Composite響應面法得到的最佳工藝參數為用鹽量3.37g，炒制溫度150.06℃，炒制時間為12.07min。根據實驗結果，結合生產實際，確定鹽知母炮制工藝為：加鹽量3.5g/100g、溶解鹽用水量為30mL/100g、悶潤時間為2～4h，炒制溫度為（150±10）℃，炒制時間為12min。并對此工藝進行驗證。證明此炮制工藝可行，可用于實際生產。

表4 模型擬合度

4 討論

星點設計（central composite design，CCD）是一種新型的試驗設計方法，是由數學方法和統計學方法結合而產生的，既二者的結合體[11]。盡管效應對因素的真實效應面不可能完全用數學模型表達，但可以用某一數學模型近似進行模擬，依據該模型描繪的效應面進行條件優選，效應面法使用起來直觀、方便、效果較好。近幾年來，CCD設計效應面法在藥學領域的范圍內具有非常好的推廣應用前景與價值[12-13]。本研究運用星點設計-效應面法，進一步對鹽制知母的炮制工藝進行優化，為其在今后的生產中提供更加合理的依據。

圖3 各因素對總評OD影響的三維效應面

本研究以鹽知母降血糖作用為切入點，進行了知母、鹽知母的化學成分含量比較及HPLC-UV、HPLC-CAD指紋圖譜比較，對知母炮制前后知母皂苷及芒果苷的含量進行對比時發現，知母鹽炙后知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ和知母皂苷AⅢ含量升高，知母皂苷E的含量降低，并對幾種皂苷之間的轉化做了推測，知母皂苷E為受熱發生裂解生成知母皂苷BII，知母皂苷BII再發生脫水反應，生成知母皂苷BIII和知母皂苷A III[14]。對知母中雙苯吡酮類成分的研究發現鹽炙后新芒果苷、異芒果苷的含量減少，芒果苷的含量增加。分析了新芒果苷、芒果苷在炮制過程中可能發生的轉化，即新芒果苷的糖苷基（O-glc）在發生斷裂，轉化成芒果苷，使芒果苷含量升高[15]。

此次進行工藝優化研究，我們考慮從生產實際出發，單因素考察結合經驗，采用星點設計效應面法，以加鹽量、炒制時間、炒制溫度為影響因素，結合炮制機理，結合活性成分在炮制過程中的變化規律，以知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷含量為考察指標，確定鹽知母炮制工藝研究。

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