內鏡下制備胃食管反流病動物模型的方法研究

孫賢久 秦先鋒 郭少卿 劉思純 左海軍 張 莉

中山大學附屬東華醫院消化科，廣東東莞 523110

胃食管反流（gastroesophageal reflus disease，GERD）主要是指由于各種因素造成十二指腸或胃的內容物返回到食管中進而引發的并發癥或癥狀[1]。臨床上GERD主要表現為燒心、惡心和發酸等癥狀，重者還會導致食管狹窄、出血、糜爛等嚴重影響患者的生活質量。目前臨床上關于GERD的治療有許多種方法，包括內科治療（藥物治療）、外科治療以及微創治療等。內科治療通常無法根治，患者需要長期服藥，且易復發因此臨床上主要用于輕度胃食管反流患者的治療；外科治療雖然效果顯著，但是對患者創傷較大，易引起各類手術并發癥，近年來隨著微創技術的不斷發展，逐漸被微創治療所取代。目前關于GERD的內鏡治療是近年來國內外的研究熱點，但其安全性及療效仍需大量的動物實驗或臨床實驗證實[2-3]。而制備合適的胃食管反流并動物模型對于實驗研究的準確性至關重要[4-5]。本研究中提出了一種內鏡下環形肌切開術制備胃食管反流病動物模型的方法，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取健康6～12月齡的Beagle實驗犬12只，其中雌犬和雄犬各6只，體質量10～12kg。速眠新II麻醉藥，甲醛溶液，腎上腺素，靛胭脂，多導腸胃功能測定儀，pH動態檢測記錄儀，光學顯微鏡。

1.2 方法

采用內鏡下環形肌切開術制備胃食管反流病動物模型，具體步驟如下：（1）術前準備：實驗犬在術前禁食禁水1d，以0.1～0.15mg/kg的速眠新II號對實驗犬進行靜脈全麻，無需進行氣管插管，使所有實驗犬可以進行自主呼吸，若實驗犬在麻醉后仍然存在躁動等狀態，應適當增加麻醉藥的使用劑量。在內鏡下測量門齒到賁門之間的距離，在胃和食管交界處的上端7～10cm處切開黏膜層，并在右后壁黏膜處注射腎上腺素和靛胭脂，采用Hook刀將黏膜層切開1～3cm的開口，暴露黏膜的下層組織，并進行相關的分離操作。（2）食管黏膜下隧道的建立：食管黏膜下隧道建立的核心原則是與食管環形肌層保持垂直的角度，確保黏膜隧道始終處于直線型。（3）切開環形肌：在胃鏡下采用Hook刀在GEJ上端7～9cm處切入，從上到下垂直切至GEJ下段1～3cm處，暴露縱行肌，再采用Hook刀從環形肌和縱行肌的空隙中伸入，切入環形肌，在胃鏡的引導下，逐步將整個環形肌切開。

1.3 指標測定方法

1.3.1 食管壓力測定 于制備前7d和后7d分別采用多導腸胃功能測定儀測定實驗犬的食管壓力。具體測定方法如下：采用多導胃腸功能測定儀，使用高分辨四道毛細灌注測壓系統，以實驗犬胃內正常的壓力作為基準線，測定其食管壓力。

1.3.2 食管pH測定 于制備前7d和后7d分別采用pH動態檢測記錄儀檢測實驗犬食管pH值。采集實驗犬食管酸反流（pH值＜4）次數，長時間酸反流（pH＜4持續5min以上）次數，最長反流時間（pH＜4持續的最長時間）以及酸反流率。

1.3.3 病理學檢查 將實驗犬處死，取其食管組織，用甲醛溶液固定，再用石蠟進行包埋，經蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察其食管組織變化情況。

1.4 統計學處理

采用Epidata 3.0對本研究數據進行錄入校對，采用統計學軟件SPSS19.0版對數據進行統計分析，計量資料采用（x±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗犬結果

12只行內鏡下環形肌切開術的實驗犬，無死亡，全部存活，其中有8只術后出現反流，另外4只術后未出現反流，采用內鏡下環形肌切開術制備胃食管反流病動物模型的成功率為66.7%。

2.2 食管壓力情況

制備前后實驗犬食管壓力情況如下表1所示，制備前實驗犬食管壓力明顯大于制備后，差異有統計學意義（t=4.112，P ＜ 0.05）。

表1 制備前后實驗犬食管壓力情況比較（x ± s，kPa）

2.3 食管pH情況

制備前后實驗犬食管pH情況如下表2所示，制備后的實驗犬反流次數、反流最長時間和反流率均大于制備前，差異均有統計學意義（t=3.968，4.037，4.006，P ＜ 0.05），但反流＞ 5min的次數制備前與制備后差異無統計學意義（t=1.651，P＞0.05）。

2.4 病理學檢查情況

從病理學檢查情況來看，制備前的正常實驗犬食管組織呈現明顯的復層鱗狀結構，上皮層內有少量炎癥細胞存在，其他各層均正常。而制備后的實驗犬的食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況。

表2 制備前后實驗犬食管pH情況比較（x ± s）

3 討論

從國內外研究報道來看，目前制備胃食管反流病動物模型的方法可以分為兩類，即手術法和非手術法，其中手術法又可分為破壞食管下括約肌法、十二指腸或幽門結扎法、空腸或十二指腸吻合術法[6-10]。空腸或十二指腸吻合術法由于完全改變了實驗動物的消化道解剖結構，因此通常不能用于療效評價試驗，因此應用相對較少[11]；十二指腸或幽門結扎法制備的食管反流病動物模型通常存活期較短，多用于短期動物實驗研究，但無法滿足中長期動物實驗研究需求[12]；破壞食管下括約肌法雖然對實驗動物的造成的創傷較大，實驗動物具有較高的死亡率，但是其建模成功率較高，是目前應用最廣泛的制備胃食管反流病動物模型的方法[13]。非手術方法主要是指通過食管關注胃蛋白酶或酸制備簡單的食管反流模型，但該法制備的食管反流模型通常僅適用于食管黏膜的損害、防御機制研究[14-15]。

本研究中提出了一種內鏡下環形肌切開術制備胃食管反流病動物模型的方法，為了探討內鏡下環形肌切開術制備胃食管反流病動物模型的可行性，本研究選取了健康6～12月齡的Beagle實驗犬12只進行研究，結果表明12只行內鏡下環形肌切開術的實驗犬，無死亡，全部存活，其中有8只術后出現反流，另外4只術后未出現反流，建模成功率為66.7%。備前實驗犬食管壓力明顯大于制備后，差異有統計學意義（t=4.112，P＜0.05）。制備后的實驗犬反流次數、反流最長時間和反流率均大于制備前，差異均有統計學意義（t=3.968，4.037，4.006，P＜0.05），但反流＞5min的次數制備前與制備后差異無統計學意義（t=1.651，P＞0.05）。從病理學檢查情況來看，制備前的正常實驗犬食管組織呈現明顯的復層鱗狀結構，上皮層內有少量炎癥細胞存在，其他各層均正常。而制備后的實驗犬的食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況。

總而言之，內鏡下環形肌切開術是一種簡單可靠的制備胃食管反流病動物模型的方法，該法制備胃食管反流病動物模型具有成功率高，不影響實驗動物解剖結構，與胃食管反流發病機制吻合等特點，可用于評價胃食管反流的內鏡治療或手術治療的療效觀察，值得進行推廣應用。

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