黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究

劉建平，何建峰

邯鄲市中醫院，河北 邯鄲 056001

肺缺血再灌注損傷是臨床上開展肺移植、體外循環心臟手術以及機體大出血時常發生的并發癥，病理機制非常復雜，其中再灌注后肺水腫的出現、氧自由基的大量生成與過剩而誘發的氧化應激損傷以及繼發性肺細胞凋亡被認為是造成肺缺血再灌注損傷的關鍵因素［1-2］。黃芪甲苷為我國傳統中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗炎、降血脂等多種藥理學活性［3-4］。近年來，李鐵成等［5］和馬小亮等［6］通過動物實驗研究發現，黃芪甲苷能夠通過改善抗氧化酶活性、提高自由基清除能力、抑制細胞凋亡而表現出對肝組織缺血在灌注損傷大鼠和心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，但黃芪甲苷是否對肺缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用尚未見文獻報道。本實驗通過夾閉左肺門45分鐘后松夾的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型，研究黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 黃芪甲苷(成都錦泰和醫藥化學技術有限公司，批號：150114，純度≥98%)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；HE、TUNEL試劑盒購于北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠7周齡，體質量220～260 g，由河北省實驗動物中心提供［動物實驗許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，動物實驗合格證號：201410012］。

1.3 動物分組與模型制備 取50只實驗用大鼠隨機分為假手術組、模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量組(20、40、80 mg/kg)組，每組 10 只；黃芪甲苷各治療組分別于術前30分鐘由腹腔注射給藥，假手術組和模型組分別給予等體積的生理鹽水。除假手術組外，其余各組大鼠均參照Xia ZY等［7］報道的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型：經腹腔注射烏拉坦實施麻醉后，行氣管插管，連接動物呼吸機(設置頻率為50次/min，呼吸比例為1∶1，潮氣量為10 mL/kg)，于左胸第4肋和第5肋間開胸，游離左肺門后，用無創血管夾閉左肺門，45分鐘后松夾以恢復血流，整個過程輔助機械通氣；假手術組行手術通路，除不夾閉左肺門外，其余操作同手術組。再灌注2小時后，實施麻醉后開腹經輔助動脈取血，1 500 rpm離心10分鐘取上層血清；開胸取左肺下葉組織，進行各指標的檢測。

1.4 肺組織W/D的測定 肺組織經生理鹽水沖

洗干凈并用濾紙吸干后，稱重為濕重(W)；置于60℃烘干箱 24小時后稱重為干重(D)，平行計算各組大鼠兩者之比為肺組織W/D。

1.5 肺組織中抗氧化酶活性的檢測 肺組織用冷生理鹽水沖洗干凈后，加入適量冷裂解液行研磨勻漿，按照各試劑盒操作方法步驟，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠肺組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性。

1.6 血清中M PO活性、M D A含量的檢測 然后按照試劑盒操作步驟，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量。

1.7 肺組織形態結構的觀察 肺組織經4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后，行常規HE染色，然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠肺組織形態結構改變。

1.8 肺細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數 (A I)的計算 取經“1.7”項制備的肺組織石蠟切片，按試劑盒操作步驟依次進行處理后行TUNEL染色，然后通過光學顯微鏡平行觀察肺組織細胞凋亡狀況(細胞核黃褐色為陽性著色)；AI的計算：每張切片隨機選取6個視野，計數每個視野中肺細胞總數和陽性凋亡細胞數，然后計算各組大鼠肺組織細胞AI：AI(%)=(凋亡細胞數/肺總細胞數)×100%

1.9 統計學方法 運用SPSS 15.0進行統計分析，計量資料以(s)表示，組間均數比較采用單因素方差分析；計數資料采用 χ2檢驗；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織W/D 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織W/D顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷中、高劑量組(40、80 mg/kg)W/D顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織W/D比較(s)

表1 各組大鼠肺組織W/D比較(s)

注：與假手術組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，＊表示 P＜0.05,＊＊表示 P＜0.01

組別 只數 劑量/(mg·kg-1) W/D/%假手術組 10 - 5.1±0.3模型組 10 - 6.4±0.7△△黃芪甲苷低劑量 10 20 6.0±0.5黃芪甲苷中劑量 10 40 5.7±0.4＊黃芪甲苷高劑量 10 80 5.4±0.3＊＊

2.2 各組大鼠肺組織抗氧化酶活性 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷(40、80mg/kg)組SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量 與假手術組比較，模型組大鼠血清中MPO活性、MDA含量顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷(40、80 mg/kg)組MPO活性、MDA含量顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表2 各組大鼠肺組織SOD、GSH-Px、CAT活性比較(s)

表2 各組大鼠肺組織SOD、GSH-Px、CAT活性比較(s)

注：與假手術組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較：＊表示P＜0.05,＊＊表示P＜0.01

組別 只數 劑量/(mg·kg-1) SOD/(U·mgprot-1) GSH-Px/(U·mgprot-1) CAT/(U·mgprot-1)假手術組 10 - 16.2±1.4 106.4±13.6 2.0±0.4模型組 10 - 10.7±1.2△△ 83.5±11.7△△ 0.9±0.2△△黃芪甲苷低劑量 10 20 12.0±1.6 87.3±10.9 1.1±0.3黃芪甲苷中劑量 10 40 13.5±1.4＊ 94.2±13.1 1.4±0.5＊黃芪甲苷高劑量 10 80 15.0±1.7＊＊ 102.3±15.0＊＊ 1.7±0.4＊＊

表3 各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量比較(s)

表3 各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量比較(s)

注：與假手術組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，＊表示P＜0.05,＊＊表示P＜0.01

組別 只數 劑量/(mg·kg-1) MPO(IU·L-1) MDA(nmol·L-1)假手術組 10 - 3.6±0.5 3.1±0.4模型組 10 - 9.4±1.7△△ 8.5±0.6△△黃芪甲苷低劑量 10 20 7.5±1.8 7.4±0.8黃芪甲苷中劑量 10 40 5.3±1.5＊ 5.6±0.6＊＊黃芪甲苷高劑量 10 80 4.2±1.6＊＊ 4.3±0.5＊＊

2.4 各組大鼠肺組織形態結構 假手術組大鼠肺組織結構和細胞形態均未見異常；模型組大鼠肺組織呈現肺泡結構紊亂，上皮細胞變性、壞死，肺泡內有大量的液體滲出，炎癥細胞浸潤等明顯的病理性形態學改變；而與模型組比較，黃芪甲苷(40、80 mg/kg)組肺組織病理性形態學變化明顯改善，以黃芪甲苷(80 mg/kg)組效果最為顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態結構(HE×400)

2.5 各組大鼠肺細胞凋亡狀況及A I 經TUNEL染色后假手術組大鼠肺組織可見極少量凋亡細胞，而模型組大鼠肺組織細胞凋亡狀況較假手術組明顯加重；與模型組比較，黃芪甲苷各組細胞凋亡狀況呈不同程度改善，其中以黃芪甲苷高劑量組效果最為顯著。見圖2。計算AI發現：與假手術組比較，模型組大鼠肺組織細胞AI明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷(40、80 mg/kg)組AI顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

圖2 各組大鼠肺組織細胞凋亡狀況(TUNEL)

表4 各組大鼠肺細胞凋亡率(s)

表4 各組大鼠肺細胞凋亡率(s)

注：與假手術組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，＊＊表示P＜0.01

組別 只數 劑量/(mg·kg-1) 凋亡率/%假手術組 10 - 2.3±0.7模型組 10 - 34.8±4.5△△黃芪甲苷低劑量 10 20 37.5±4.1黃芪甲苷中劑量 10 40 26.6±3.2＊＊黃芪甲苷高劑量 10 80 18.0±2.5＊＊

3 討論

肺缺血再灌注損傷病理機制非常復雜，廖秀清等［1］和柴軍等［2］研究發現，再灌注后出現的廣泛的氧化應激損傷和肺細胞凋亡是肺缺血再灌注損傷發生發展的重要因素。劉國輝等［8］和程建等［9］通過藥物干預肺缺血再灌注大鼠模型，抑制肺細胞凋亡從而對大鼠肺缺血再灌注損傷起到保護作用，為我們今后研發緩解肺缺血再灌注損傷的新型藥物提供了新的思路。

黃芪甲苷為我國傳統中藥黃芪的主要有效成分之一，具有多種藥理學活性。本實驗對采用夾閉左肺門45 min后松夾的方法制備的肺缺血再灌注損傷大鼠模型進行研究發現，經黃芪甲苷中、高劑量組(40、80 mg/kg)預處理能夠顯著降低肺缺血再灌注損傷大鼠W/D、改善肺組織形態結構和細胞形態病變、抑制肺細胞凋亡，提示黃芪甲苷對肺缺血再灌注大鼠具有保護作用。

正常生理狀態下，體內生成的氧自由基能夠在超氧化物歧化酶(SOD)催化作用下還原生成H2O2［10］，并進一步在GSH-Px或CAT的作用下還原生成對人體無害的 H2O 和 O2［11］，因此 SOD、GSH-Px、CAT 的活性能夠反映機體抗氧化能力；脂質過氧化終產物丙二醛(MDA)水平能夠間接反映機體氧化應激損傷程度。髓過氧化物酶(MPO)是中性粒細胞特有的酶，其活性能夠反映中性粒細胞激活和浸潤，也能間接反映組織氧化應激損傷程度［12］。細胞凋亡是一種可由多種因素誘發的繼發性行為，而氧化應激損傷正是誘發細胞凋亡的重要因素之一。本研究發現：經黃芪甲苷(40、80 mg/kg)預處理能夠有效改善抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低血清中 MPO 活性和MDA含量；提示黃芪甲苷具有降低肺缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷的作用，從而間接抑制肺細胞凋亡。

總之，黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制可能與番茄紅素能夠有效改善機體抗氧化酶活性、抑制肺組織氧化應激損傷以及抑制肺細胞凋亡有關。

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