益元生血方對再生障礙性貧血患者外周血T淋巴細胞亞群的影響*

申小惠，張文君，楊新蔚，展 銳，溫少瑾甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一組以造血干祖細胞損傷、全血細胞減少為主要臨床表現的骨髓造血功能衰竭性疾病，也是一種以造血組織為靶細胞的自身免疫性疾病。臨床主要表現為全血細胞減少導致的貧血、出血和感染。目前多數學者認為AA是一種與CD4+T細胞亞群功能異常有關，由T細胞介導的自身免疫性疾?。?］。AA患者免疫異常會使機體Th1/Th2 T淋巴細胞群比例失調、CD4+/CD8+T細胞亞群比例嚴重紊亂，使機體產生各種負性調控因子(如IFN-γ和TNF-α等)，抑制正常造血干細胞生長，最終引起骨髓衰竭［2］。其中Th17細胞作為促炎細胞，可誘導自身免疫性疾病的發生；而Treg細胞則具有抗炎和維持自身免疫耐受的作用，兩者在細胞分化發育過程中存在著制約關系，Treg/Th17細胞失衡可導致許多自身免疫性疾病的發生［3-4］。目前已有研究表明AA外周血中Treg細胞明顯減少，而Th17細胞顯著升高［5-6］，可以肯定Treg/Th17細胞的比例與AA的發病、預后密切相關。近年來，筆者就以健脾補腎、調氣和血、化瘀解毒為立法依據的自擬益元生血方對AA患者外周血T細胞免疫的調節作用進行了觀察，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據隨機對照表選取2014年1月至2016年5月在甘肅省中醫院腫瘤血液科二部就診的10例AA患者為觀察組，其中男6例，女4例；年齡40～70歲，平均(52.34±16.03)歲。另選健康對照者10例為對照組，其中男5例，女5例；年齡 40～70歲，平均(56.24±14.14)歲。2組性別、年齡等基礎資料比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 納入標準 納入：1)符合AA西醫診斷標準［7］者；2)中醫辨證屬脾腎虧損，邪毒內蘊證型［8］者；3)已停用化療藥物、造血生長因子或糖皮質激素2周以上者；4)未經抗生素或抗病毒藥物治療的活動性感染者；5)本人同意參與此項試驗研究，依從性好，資料完整，可隨訪者；6)納入者經醫學倫理委員會審定同意。

1.3 排除標準 排除：1)不符合上述納入標準者；2)對本方案治療藥物過敏者；3)妊娠期或哺乳期婦女；4)精神疾病患者；5)合并其他血液系統或非血液系統腫瘤，或有較嚴重的心、肝、腎等重要臟器器質性病變者；6)依從性差或因各種原因終止研究可能性大、不能完成研究流程者；7)病情危重，難以對本次實驗的有效性作出確切評價者。

1.4 實驗藥物 益元生血方藥物組成：黃芪20 g，菟絲子15 g，女貞子20 g，何首烏15 g，丹參10 g，三七10 g，雞血藤10 g，白花蛇舌草10 g，半枝蓮10 g，牡丹皮 15 g，白術 12 g，黨參 15 g，當歸 10 g，生地黃10 g。上述藥物均由甘肅省中醫院提供。1.5 實驗試劑 人淋巴細胞分離液(深圳達科為公司)；FITC anti-human CD4、PerCP/Cy5.5 anti-human CD8、PE anti-human IL-17A、APC anti-human IFN-γ、APC anti-human IL-4、PE anti-human CD25、PMA+Ionomycin淋巴細胞刺激物、Cell Staining Buffer(美國Biolegend公司)；改良型RPMI-1640培養基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；益元生血方水提物(甘肅省中醫院制劑中心提供)。

1.6 實驗儀器 顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；低溫冰箱(廣州菱志電子公司)；離心機(北京亞泰科隆儀器技術有限公司)；A06061422超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；酶聯儀(美國BIO-RAD公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.7 實驗方法

1.7.1 AA患者外周血T淋巴細胞與益元生血方水提物共培養后時效量效關系測定 無菌抽取診斷后治療前AA患者和正常人對照組外周血5mL，用EDTA抗凝后，加入人外周血淋巴細胞分離液5 mL，1 500 r/min，離心后，沉淀為淋巴細胞，棄上清液，并加入1 mL培養液于沉淀中，吹勻，調整細胞密度為 7×104個 /mL，每孔 100 μL。將益元生血方水提物用完全RPMI-1640稀釋至以下濃度10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%，每孔 100 μL 加入到含各組淋巴細胞懸液的96孔板中，每個濃度梯度設10個復孔，同時設正常人淋巴細胞懸液+完全RPMI-1640培養液，設完全RPMI-1640培養液空白對照組、培養時間分別為24、36、48、72小時。培養結束前4小時各孔加MTS(濃度為5 mg/mL)20 μL，繼續CO2培養箱孵育4小時后，酶標儀570 nm處檢測吸光度值，并用完全RPMI-1640培養液空白對照孔調零，結果用OD值表示，依據MTS的實驗結果以確定最佳藥物濃度和最佳培養時間，進行后續實驗。

1.7.2 干預方法 采集2組研究對象外周血5 mL，制備外周血淋巴細胞懸液，將制備好的淋巴細胞混懸液加入到24孔板中，細胞濃度為2×l07個/mL，每孔500 μL。觀察組淋巴細胞懸液加入5%益元生血方水提取物、對照組淋巴細胞懸液予同劑量完全RPMI-1640培養液，每孔500 μL，每組設10個復孔，CO2培養箱培養36后，各組分別標記收集在2 mL離心管中，2 500 r/min，離心5分鐘，棄上清液。1 mol/L PBS洗滌細胞沉淀，用1 mL PBS重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為1×107個/mL。取各組細胞懸液300 μL分別加入到3個2 mL離心管中，第 1 管加 FITC- 抗人 CD4 0.5 μL，PerCP/cy5.5-抗人 CD8 5 μL；第 2 管加 APC- 抗人 IFN-γ 5 μL，APC-抗人IL-4 5 μL；第3管加PE-抗人IL-17A1.25μL，PE-抗人CD251.25μL，混勻。4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗細胞3次，洗畢，2 500 r/min離心5分鐘，棄上清，加500 μL PBS于細胞沉淀中，輕輕吹勻，上流式細胞儀檢測。

1.8 觀 察 指 標 2 組 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細胞亞群的分化；益元生血方干預前后 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細胞亞群的分化。

1.9 統計學方法 數據采用SPSS 21.0統計軟件進行統分析，所有數據均以(s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A A患者外周血T淋巴細胞與益元生血方水提物共培養后時量效關系測定 培養時間為36小時時，各組T淋巴細胞增殖活性均優于24、48和72小時，藥物濃度為5%時各組T淋巴細胞增殖活性均優于 10%、2.5%、1.25%、0.625%，但都達不到正常組水平，差異具有統計學意義(P＞0.05)。因此，后續實驗研究將培養時間定為36小時，藥物濃度定為5%，見表1。

2.2 外 周 血 CD4+、CD 8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD 4+CD 25+T淋巴細胞 與正常對照組比較，觀察組外周血 CD4+、CD4+/CD8+、IL-4、CD4+CD25+的表達明顯下降(P＜0.05)，CD8+、IFN-γ、IL-17 的表達顯著升高(P＜0.05)。見表2。

2.3 益元生血方水提物干預后A A患者外周血CD4+、CD 8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細胞變化 與干預前比較，干預后CD4+、CD4+/CD8+、IL-4、CD4+CD25+的 表 達 下 降 (P ＜0.05)，CD8+、IFN-γ、IL-17 的表達顯著升高(P＜0.05)。見表3。

3 討論

AA的發病與免疫紊亂關系密切，異常的免疫反應可損傷造血干細胞［9］。CD4+T細胞在維持機體的正常免疫應答中起著重要作用，其細胞的分化和細胞因子的異常調節在炎癥及自身免疫性疾病中發揮重要作用。CD4+T細胞又分為Th1、Th2、Th17及調節性T細胞，其中Th1主要輔助細胞免疫，分泌IL-2及IFN-γ等。Th1細胞激活程度與機體造血功能呈負相關，同時IFN-γ可抑制正常骨髓細胞的分化、增殖、對造血干、祖細胞生長起抑制作用［10］。Th2則主要輔助體液免疫，分泌IL-4及IL-13等。Th1/Th2細胞的極化在機體免疫應答調節中發揮著重要作用，研究發現AA患者出現Th1細胞極化現象，呈現Th1細胞優勢反應，而Th1/Th2細胞比例明顯失衡［11］。Th17細胞與多種自身免疫性疾病關系密切，主要分泌IL-17等，IL-17可通過刺激內皮細胞發揮TGF-β等細胞因子，對骨髓造血發揮抑制作用，且IL-17可直接活化髓系祖細胞NF-κB，抑制祖細胞的增殖或促進其凋亡［12］。CD4+Treg細胞大約占CD4+T細胞的5%～10%，表達CD25分子和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA-4)，活化的CD4+CD25+Treg主要通過接觸抑制的方式抑制T細胞的活化和增殖，其通過抑制效應CD8+T細胞促進骨髓造血恢復［13］。而CD8+T細胞被異常激活后，可抑制自體及異體祖細胞集落形成，說明其與造血功能衰竭密切相關［14］。

表1 2組A A患者外周血T淋巴細胞與益元生血方水提物共培養后時效量效關系測定比較(s)

表1 2組A A患者外周血T淋巴細胞與益元生血方水提物共培養后時效量效關系測定比較(s)

注：＊表示與對照組同培養時間比較，P＜0.05；#表示相同濃度間比較，P＜0.05；△表示相同時間點組間比較，P＜0.05

組別 例數 藥物濃度/% 不同培養時間增殖活性/h 24 36 48 72對照組 10 - 0.236±0.016 0.409±0.007 0.275±0.002 0.230±0.012觀察組 10 10 0.052±0.005＊ 0.082±0.006＊ 0.084±0.003＊ 0.082±0.008＊5 0.128±0.009＊ 0.188±0.008＊#△ 0.125±0.014＊ 0.121±0.008＊2.5 0.109±0.010＊ 0.109±0.012＊ 0.078±0.006＊ 0.078±0.009＊1.25 0.075±0.008＊ 0.078±0.006＊ 0.052±0.006＊ 0.045±0.006＊0.625 0.050±0.004＊ 0.062±0.012＊ 0.044±0.004＊ 0.041±0.003＊

表2 2 組外周血 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T 淋巴細胞亞群百分率比較(s)

表2 2 組外周血 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T 淋巴細胞亞群百分率比較(s)

注：＊表示與對照組比較，P＜0.05

組別 例數 CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+ IFN-γ/% IL-4% IL-17/%CD4+CD25+/%對照組 10 55.67±3.24 34.81±2.65 1.61±0.17 11.16±0.54 6.24±0.21 2.29±0.23 5.2±0.57觀察組 10 39.29±2.83＊ 40.11±2.41＊ 0.98±0.21＊ 14.16±0.81＊ 3.68±0.39＊ 16.17±0.72＊ 2.98±0.28＊t 11.17 6.76 1.63 10.39 18.18 61.29 12.17

表3 益元生血方水提物干預前后AA患者外周血CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細胞變化(s)

表3 益元生血方水提物干預前后AA患者外周血CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細胞變化(s)

注：＊表示與益元生血方干預后比較，P＜0.05

干預前 10 51.24±2.83＊ 38.52±1.55＊ 1.33±0.08＊ 13.21±0.73＊ 4.68±0.48＊ 12.29±0.41＊ 2.98±0.28＊干預后 10 39.29±2.83 40.11±2.41 0.98±0.21 14.16±0.81 3.68±0.39 16.17±0.72 2.24±0.31 t 9.30 4.68 1.53 9.16 7.31 11.41 7.74

本實驗研究發現AA患者外周血中CD4+、IL-4、CD4+CD25+的表達明顯下降，CD8+、IFN-γ、IL-17 的表達顯著升高。這與文獻報道一致［15］。AA是通過免疫機制介導的一種自身免疫性疾病，本研究再次證實AA的發病機制與免疫功能的紊亂有一定的相關性。AA屬中醫“虛勞”“血證”范疇,臨床上均有脾腎虧損、瘀毒內停的表現。中醫認為脾腎虧損、瘀毒內停是AA的主要病機，本研究采用健脾補腎、調氣和血、化瘀解毒的方法，自擬“益元生血方”治療此病。該方由黃芪、白術、黨參、菟絲子、女貞子、當歸、何首烏、生地黃、丹參、三七、雞血藤、白花蛇舌草、半枝蓮、炒牡丹皮等組成，諸藥相合，甘溫助陽，養血和營，化瘀解毒，使臟腑得以運化，血液得以化生；滋陰與溫陽并舉，補虛而不壅滯，祛邪而不傷正，標本兼顧，動靜結合，寒溫并濟，共奏健脾補腎，活血解毒之功。益元生血方水提物與AA患者外周血共培養后，AA患者外周血CD4+、IL-4、CD4+CD25+的表達升高，CD8+T 細胞，IFN-γ、IL-17的表達下降。

綜上所述，益元生血方可以增加AA患者外周血 CD4+、IL-4、CD4+CD25+的表達，下調 CD8+T 細胞、IFN-γ、IL-17的表達，益元生血方可能通過調節AA患者免疫功能以發揮治療的作用。益元生血方是我們長期臨床實踐的經驗總結，療效顯著，但限于樣本數有限，未能進行系統全面的分子學，蛋白組學研究其機制，在后續實驗研究中將進一步對其機制進行深入研究。

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