進水pH值對CASS工藝處理低濃度生活污水中氧化亞氮排放的影響

毛念佳，嵇鴻民，許 柯，任洪強，李穎瑜

（南京大學環境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇南京 210046）

氧化亞氮（N2O）是大氣中含量僅次于CO2和CH4的溫室氣體，其在污水生物處理過程中的排放日益受到關注［1］。美國環保署報告稱，污水處理過程中釋放的N2O占總釋放量的3%［2］。IPCC報告中指出，污水處理廠污水處理過程中大約0.05%～25%的氮被轉化成N2O形式釋放，約占全球N2O總排放量的1.2%［3］。因此，深入了解污水處理過程中N2O的產生機理和減量控制具有重要意義。

周期循環活性污泥法（cyclic activated sludge system，CASS）是基于SBR工藝的一種新型污水處理技術，因其系統組成簡單、操作運行靈活多變、基建費用低和可靠性好等特點，在國內外得到了廣泛的應用［4-5］，當前關于污水生物脫氮過程中N2O釋放特征的研究主要以SBR、AAO、氧化溝等工藝為主［6-7］，而對于CASS工藝脫氮過程中N2O的排放及機理研究較少。

pH作為CASS工藝運行中的實時控制參數，對微生物的代謝活動具有重要影響，同時對生物脫氮過程中某些物質（如游離氨、HNO2等）的存在及濃度產生影響，是控制生物脫氮過程正常進行和影響N2O產生量的重要條件。本研究考察了進水pH對CASS工藝過程中N2O排放的影響，并從微生物群落結構、功能基因層面分析N2O產生機理，旨在為實際工藝運行中N2O的減排提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與運行條件

試驗所用CASS反應器由有機玻璃制成，如圖1所示。反應器長43 cm、寬11 cm、高15 cm，水面超高5 cm，有效容積為4.66 L。生物選擇區、缺氧區和主反應區容積分別為0.25、0.33 L和4.08 L。模擬污水經由蠕動泵進入反應器，通過電磁閥控制出水。

圖1 CASS反應器示意圖Fig.1 Schematic Diagram of CASS Reactor

本試驗采用間歇進水，一個周期包括了進水、曝氣、沉淀、排水這四個階段，運行時間分別為0.8、2、1、1 h，共4.8 h。裝置由電子計時器控制開關，可實現周期式自動連續運行。每周期進水1.86 L，出水后剩余體積2.80 L，排水比40%。接種污泥取自南京江心洲污水處理廠，污泥濃度在3 000 mg／L左右；反應器末端設有污泥回流管，污泥經回流泵進入生物選擇區，污泥回流率為20%。

1.2 模擬污水

本試驗采用模擬污水，組分為：一水合葡萄糖，51 mg／L；蛋白胨，100 mg／L；氯化銨，80 mg／L；磷酸二氫鉀，13 mg／L；七水合硫酸鎂，25 mg／L；二水合氯化鈣，11 mg／L；微量元素濃縮液，0.6 mL ／L。微量元素濃縮液組分為：FeCl3·6H2O，1.50 mg／L；KI，0.18 mg／L；ZnSO4· 7H2O， 0.12 mg／L；H3BO3，0.15 mg／L；MnCl2· 4H2O，0.12 mg／L；CoCl2·6H2O，0.15 mg／L；CuSO4· 5H2O， 0.03 mg／L；Na2MoO4·2H2O，0.06 mg／L；EDTA，10 mg／L。主要營養物質濃度為：COD150mg／L，NH＋4_N 21 mg／L，

TN 36 mg／L，TP 3 mg／L，五個反應器進水 pH 值分別調節為 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0。

1.3 分析方法

1.4 實時熒光定量PCR分析

試驗采用SYBR Green染料法，對污泥中反硝化功能基因nirS（編碼的血紅素cd1型亞硝酸還原酶）、nirK（編碼銅型亞硝酸還原酶）、nosZ（N2O還原酶催化中心）進行定量分析［9］。以大腸桿菌感受態細胞制備質粒標準品，建立標準曲線（R2＞0.999），擴增程序實時熒光定量 PCR儀 AB7500（Life Technologies，美國）進行，熱循環過程為：95℃ 3 min，40個循環的95℃ 20 s，退火 30 s，72℃延伸 40 s。反應體 系為 25 μL，含 12.5 μL 2 ×SYBR?Green PCR Master Mix（Vazyme，中國），2 μL模板 DNA （20 ng／μL），正反向引物各 0.5 μL（20 μmol／L），9.5 μL 無菌超純水，每個樣品做三個平行樣。以標準品拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標，做標準曲線，對待測功能基因或細菌定量，計算其拷貝數，如表1所示。

表1 目標基因的引物序列及退火溫度Tab.1 Primer Sequences for Target Genes and Corresponding Annealing Temperature

1.5 16S rRNA高通量測序

以FastDNA Spin Kit for soil試劑盒提取污泥DNA，稀釋至20 ng／μL后用于16S rRNA基因V1-V2區域PCR擴增，每個樣品做四個平行樣。PCR擴增 中 用 到 的 正 向 引 物 序 列 （5′-3′）為AGAGTTTGATYMTGGCTCAG，反向引物序列（5′-3′）為 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCR。擴增體系為50 μL，包含 2 × EasyTaq?PCR SuperMix 25 μL，正向和 反 向 引 物 （10 μmol／L）各 1 μL，DNA 模 板2 μL，超純水21 μL。PCR 擴增過程為：首先 98℃預熱5 min，再經過擴增程序，其中98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，此擴增程序循環20次，最終72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將平行樣合并，用E.Z.N.A.TM Cycle-Pure試劑盒（Omega Bio-tek Inc.，USA）對擴增產物純化，再用超微量分光光度儀測定純化樣品濃度和純度。

純化產物送至江蘇中宜金大分析檢測公司進行Miseq高通量測序，所得的結果通過 Sickle軟件，Mothur軟件對樣品數據進行降噪處理，獲得序列結果，進行多樣本深度歸一化處理后，通過R語言程序（R version 3.1.1）繪制熱圖。

2 結果與討論

2.1 不同進水pH條件下氮的轉化過程

本研究考察了穩定運行20 d（2倍污泥齡）后，各反應器在不同進水pH下一周期內濃度變化，結果如圖2所示。由圖 2可知，進水 pH 值為 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0時去除率分別為39.5%、65.1%、82.4%、98.0%、99.7%，TN去除率分別為 37.5%、37.1%、40.3%、42.6%、45.7%。隨著進水pH的增加，和TN去除率都上升，pH對去除效果影響更大。當進水pH值高于8.4時，N可基本完全去除。為保證較好的脫氮效果，CASS工藝進水pH值最好維持在7.8以上。

由于硝化反應的進行消耗堿度，pH的提高會促進好氧段硝化反應的進行。進水pH值為9.0時，曝氣90 min后幾乎所有被完全氧化。當進水pH值從6.6增加到9.0時，更多的被硝化菌氧化為最大濃度從9.66 mg／L 增加到 19.70 mg／L。濃度的增多也提高了活性污泥沉淀時缺氧反硝化速率。因此，TN去除率也隨進水pH的提高而有所增加。

2.2 不同進水pH條件下N2O的釋放特征

本研究考察了不同進水pH下CASS反應器曝氣階段N2O排放速率及一周期溶解性N2O濃度變化，結果如圖3所示。進水pH值為6.6～8.4時，N2O排放速率在曝氣開始時出現峰值（0.03～0.09 mg N／min），隨后逐漸降低，并保持在較低水平（約0.01 mg N／min）。而當進水pH值增加到9.0時，曝氣開始時N2O排放速率僅為0.01 mg N／min，在曝氣過程中稍有上升，曝氣30 min后N2O排放速率（0.02 mg N／min）高于其他反應器。進水pH值為9.0的反應器溶解性N2O濃度在整個周期都低于0.1 mg／L。

不同進水pH下CASS反應器N2O的釋放量、轉化率及在沉淀出水階段的產生量如圖4所示。隨著進水pH值從6.6提高到9.0，每周期N2O排放量從0.32 mg N／L增加到0.52 mg N／L。不同進水pH下N2O轉化率差別較小，為6.02%～7.92%，進水pH值為6.6時N2O轉化率最低，而進水pH值為9.0時最高。沉淀出水階段的N2O產生量在pH值為6.6～7.8時隨pH的提高從1.28 mg N增加到7.02 mg N，但隨著進水pH的繼續增加，N2O產生量迅速減少，在進水pH值為9.0時完全沒有N2O產生。

圖2 不同進水pH值下反應器中污染物濃度變化 （a）6.6；（b）7.2；（c）7.8；（d）8.4；（e）9.0Fig.2 Variation of Pollutant Concentration under Different Influent pH Value（a）6.6；（b）7.2；（c）7.8；（d）8.4；（e）9.0

圖3 不同進水pH下曝氣階段N2O排放速率及一周期溶解性N2O濃度變化Fig.3 N2O Emission Rate during Aeration Period and Dissolved N2O Concentration in a Typical Cycle under Different Influent pH Value

圖4 不同進水pH下N2O排放特征Fig.4 N2O Emission Characteristics under Different Influent pH Value

當前關于污水處理過程進水pH與N2O排放特征關系的研究不多。Kampschreur等［12］認為與其他影響因素相比，pH的影響較小。然而，本試驗中pH對CASS工藝脫氮過程中N2O釋放特征的影響不可忽視。pH最高的反應器在硝化過程N2O排放速率高于其他反應器。Law等［13］的研究表明，在富集氨氧化細菌的活性污泥反應器中，隨著pH值從6.0增加到8.0，硝化過程N2O產生量逐漸增加，原因與較高的氨氧化速率相關。Hynes等［14］研究Nitrosomonas europeae硝化過程中N2O的產生規律時發現，與pH較低的條件相比，在pH值為8.5的有氧條件下，氨氧化細菌達到最大的NO及N2O產生速率，此時N2O產生的最主要來源是NOH的分解作用。劉越等［15］對短程硝化過程的研究表明，低DO水平下氨氧化速率的提高會引起N2O產生速率的增加，N2O的產生以羥胺氧化途徑為主。本試驗中NO－2濃度極低，較高的氨氧化速率促進氨氧化菌反硝化途徑產生N2O的可能性較小，因此進水pH的提高促進羥胺氧化途徑產生N2O。

2.3 反硝化功能基因豐度分析

不同進水pH條件下反硝化功能基因豐度如圖5所示。由圖5可知，進水pH值為8.4時nosZ和nirS基因豐度最高，分別為 3.54×108copies／mL和3.33×108copies／mL。進水 pH值為9.0的反應器nirK 基因豐度（2.12×107copies／mL）遠高于其他反應器（4.91×106～ 6.97×106copies／mL），而 nirS 基因豐度（1.55×108copies／mL）也較高，僅低于進水pH值為8.4的反應器。反硝化菌在高pH條件下數量增加，可能是這兩個反應器的TN去除率高于低pH反應器的原因之一。然而，進水pH值為9.0的反應器nosZ基因豐度并非最高，但在沉淀出水階段卻沒有N2O產生，可能的原因是pH值為9.0的條件沒有促進含有nosZ基因的反硝化菌增長，但增強了N2O還原酶的活性。Shu等［19］研究發現，在進水pH值為4.3～7.8的污水處理廠中，nosZ基因豐度與pH呈負相關關系，與本試驗中進水pH值為6.6時nosZ基因豐度高于進水pH值為7.2和7.8的結果接近。

圖5 不同進水pH下反硝化功能基因豐度Fig.5 Abundances of Denitrification Functional Genes under Different Influent pH Value

2.4 微生物群落結構分析

本試驗利用高通量測序Miseq分析了微生物群落結構，結果如圖6所示。pH對變形菌豐度影響較小，不同進水pH條件下的反應器變形菌含量分別為19.23%～23.93%，如圖6（a）所示。有研究認為在亞硝化系統中N2O的產生主要來自為Nitrosomonas的反硝化作用［20］。不同進水pH條件下，CASS工藝活性污泥中氨氧化菌（ammoniaoxidizing bacteria，AOB）主要是 Nitrosomonadales，而亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）主要是Nitrospira。隨著進水pH的增加，氨氧化菌含量在0.43%～0.63%波動，而亞硝酸鹽氧化菌含量則從2.58%增加至3.42%。Shu等［21］采用熒光定量PCR測定6個污水處理廠活性污泥硝酸鹽氧化菌（Nitrobacter和Nitrospira）的16S rRNA豐度時，發現硝酸鹽氧化菌含量也與pH呈正相關關系，與進水COD濃度呈負相關關系，pH對硝酸鹽氧化菌細胞增殖起重要作用。

圖6 不同進水pH條件下微生物群落結構（a）門水平及變形菌綱分布；（b）反硝化菌相對豐度（＞0.1%）Fig.6 Microbial Community Structure under Different Influent pH Value （a）Distribution in Phylum and Proteobacteria in Class Level；（b）Relative Abundances of Potential Denitrifying Bacteria

不同pH條件下的CASS反應器中反硝化菌相對豐度如圖6（b）所示。試驗活性污泥樣品中共檢測到59個反硝化菌屬，圖6（b）列舉了其中相對豐度最高的23個反硝化菌屬（相對豐度 ＞0.1%）。由圖6（b）可知，進水 pH 值為 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0 的反應器總反硝化菌含量分別為 5.77%、4.16%、4.76%、6.59%、3.89%。優勢反硝化菌為 Dechloromonas（1.36%～4.25%）和 Zoogloea（0.75%～1.26%）。不同pH的反應器中Dechloromonas豐度變化較大。在進水pH值為7.2～8.4時，反硝化菌豐度隨pH的增加而增加。進水pH值為9.0的反應器反硝化菌豐度最低，因此其在沉淀出水階段沒有N2O累積的原因并不是較多完全反硝化的微生物，而是N2O還原酶在高pH條件下活性更高，反硝化過程N2O還原速率高于產生速率。由于本試驗的反應器幾乎沒有亞硝酸鹽產生，即使在進水pH值為6.6的反應器中對應的游離亞硝酸濃度也極低，反硝化菌的生長繁殖沒有受到較大的抑制，pH對反硝化菌含量的影響較小。

3 結論

（2）進水pH值為6.6～8.4時，N2O排放在曝氣開始出現峰值，隨后逐漸降低，并保持較低水平（約0.01 mg N／min）；而進水pH值增加到9.0，曝氣開始時N2O排放速率較小，而后在曝氣過程中稍有提升。隨著進水pH值從6.6提高到9.0，每周期N2O排放量從0.32 mg N／L增加到0.52 mg N／L。

（3）進水pH值為8.4的反應器中nosZ和nirS基因豐度最高，而進水pH值為9.0的反應器nirK基因豐度最高。高pH條件下反硝化菌的數量增加，提高了TN去除率。

（4）不同進水pH下，污泥中氨氧化菌（AOB）主要是Nitrosomonadales，亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）主要是Nitrospira。隨著進水pH的增加，氨氧化菌含量變化不大，而亞硝酸鹽氧化菌含量則從2.58%增加至3.42%。反硝化優勢菌種為Dechloromonas（1.36%～4.25%）和 Zoogloea（0.75%～1.26%），Dechloromonas豐度隨進水pH變化較大。

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