龍眼提取物對H2O2致PC12細胞損傷的保護作用

李紅艷 倪雪嬌 陳曉霞 賈思禹 宋 婷

1. 遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用國家教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110032

龍眼俗名桂圓，其假種皮龍眼肉具有補益心脾、養血安神[1]等功效，并有改善記憶[2]、抗氧化[3]等作用。目前龍眼中僅龍眼肉作為藥用部位，對龍眼殼、核等并無有效的開發利用。據報道，龍眼殼、核具有抗氧化、抗腫瘤[4-7]等作用，實驗者認為其大量廢棄不僅給炮制加工帶來不便，同時造成了資源的浪費與環境的污染。本研究擬通過探討龍眼不同提取物的神經保護作用，為龍眼的炮制加工及擴大應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 龍眼購自大連金鴻潤食品發展有限公司，經王添敏副教授鑒定為無患子科植物龍眼(DimocarpuslonganLour.)的干燥成熟果實；PC12細胞(高分化)，遼寧中醫藥大學藥理實驗室提供；DMEM高糖培養基(Gibco)；胰蛋白酶、雙抗、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒均購自Genview；NU-4750型二氧化碳培養箱(Nuaire)。

1.2 方法

1.2.1 龍眼不同部位的制備 干燥龍眼，分離肉、殼、核，分別稱重、粉碎，各取100.00 g，按1∶12(m∶v)加入去離子水微沸提取1 h，提取3次，合并濾液，60℃減壓濃縮成浸膏，即得龍眼肉、龍眼殼、龍眼核提取物，以下簡稱龍眼肉、殼、核。

1.2.2 龍眼肉不同極性提取物的制備 精密稱取龍眼肉100.00 g，同上煎煮，向濾液中加入乙酸乙酯反復萃取至上層液體無色，收集合并上層溶液，得乙酸乙酯提取物；下層加入正丁醇反復萃取至上層無色，收集上、下層溶液，分別得正丁醇提取物和水提取物。60 ℃減壓濃縮成浸膏。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活 取對數生長期的PC12細胞，以105/mL接種于96孔板， 待細胞貼壁后，隨機分為正常組、模型組和給藥組，每組3個復孔。除正常組外，各組細胞用200 μM H2O2處理12 h，給藥組于造模12 h后加入不同濃度的受試藥物(最小濃度分別是各提取物的最低有效濃度)。繼續培養12 h后，采用MTT法于酶標儀490 nm處測定各孔吸光度(A)值，計算細胞存活率，實驗平行重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取生長狀態良好的PC12細胞，鋪于6 cm培養皿中，隨機分為正常組、模型組和龍眼肉組(乙酸乙酯提取物1.6 mg/mL)。除正常組外，其余各組加入200 μM H2O2孵育12h，龍眼肉組于造模前加藥預處理2 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡，每組3個復孔。

1.2.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 龍眼不同部位對細胞增殖的影響 顯微鏡觀察可見，正常組細胞貼壁良好，軸突明顯；模型組細胞形態不規整，突起腫脹破裂，有脫壁漂浮現象；給藥組細胞形態趨于正常，突起損傷減輕，結構較完整。各組代表性圖片如圖1A所示。MTT檢測結果表明，細胞存活率模型組較正常組下降；龍眼肉、殼、核組較模型組升高(P<0.05，P<0.01，圖2B-D)，三者平均細胞存活率無統計學差異(P>0.05)，但濃度相差懸殊(圖2E)。綜合評價，筆者認為龍眼肉提取物的神經保護作用最強。

2.2 龍眼肉不同極性提取物對細胞增殖的影響 不同極性提取物均有神經保護作用(圖2A-C)；相同濃度下，乙酸乙酯提取物促進增殖最明顯(圖2D)。如圖2所示。

2.3 龍眼肉乙酸乙酯提取物對細胞凋亡的影響 模型組較正常組活細胞數減少，凋亡及壞死細胞數增加(P<0.05，P<0.01，圖3D-G)；龍眼肉組即龍眼肉乙酸乙酯提取物較模型組活細胞數增加，中晚期凋亡及壞死細胞減少(P<0.05，圖3D、F、G)，早期凋亡細胞無統計學差異(P>0.05)，但有降低趨勢(圖3E)。如圖3所示，

3 討論

本論研究用H2O2誘導細胞損傷，并采用龍眼提取物進行預處理或治療，結果表明，龍眼肉、殼、核提取物，均能提高受損細胞存活率，且以龍眼肉用量最小，龍眼殼促進增殖作用最顯著。綜合考慮三者的量效差異，認為龍眼肉作用效果最好；同時，龍眼中殼、核所占比重不小，二者有很強的作用，如果一并入藥，可減少炮制加工，并擴大了龍眼的藥用來源。另外，根據細胞凋亡檢測結果推測，抑制中晚期細胞凋亡與壞死是龍眼神經保護作用的可能機制，值得進一步深入研究。

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