美洲大蠊提取液調控大鼠難愈合創面微絲、橋粒實驗研究

曾娟妮 楊 敏 劉 筱 李文華 周雯婷

1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410005

慢性難愈合創面因虛感邪，邪氣致瘀，經久不愈，損其正氣，正虛邪盛，不能托毒外出，瘀阻傷正，正損致腐，最終形成虛、邪、瘀、腐相互作用、互為因果的變化，其中虛是受邪的條件及血瘀傷正的結果。中醫學對難愈合創面的認識有著悠久的歷史，數千年來，歷代醫家不斷總結治療經驗，積累了煨膿長肉、祛腐生肌、活血化瘀等豐富的治療方法，但是由于中藥復方藥物成分復雜，具有多靶點、多途徑等特點，給研究帶來一定難度，其促愈機制目前探索不明。中醫藥治療慢性難愈合創面因其療效佳、費用低等特點，深受廣大醫生及患者歡迎。美洲大蠊提取液，具有通利血脈、散瘀活血、養陰生肌的作用，包含著中醫扶正驅邪相輔相成的治療法則，被廣泛應用在創面修復、胃潰瘍、腫瘤等領域[1-2]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于難愈合創面，取得滿意療效[3-4]，同時采用PCR、免疫組化等方法發現美洲大蠊提取液在肉芽生長期上調VEGF及TGF表達加速創面愈合，但促愈機制有待于進一步探討。本實驗應用日立 H7700透射電鏡(10000倍),觀察難愈合創面愈合過程中不同時間點傷口基底細胞的超微結構(微絲、橋粒)，進一步驗證美洲大蠊提取液促進慢性難愈合創面修復的作用優勢,為臨床推廣應用美洲大蠊提取液防治慢性難愈合創面提供一種可靠的治療方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物 健康成年SPF 級 Wistar 雄性大鼠40只(NO.43004700026384)，12 周齡，體重 220g～250g，適應性喂養 1 周。

1.1.2 藥材 美洲大蠊提取液組所敷紗條用美洲大蠊提取液(康復新，國藥準字Z43020995，湖南中南科倫藥業有限公司)。貝復濟組所敷紗條用貝復濟(國藥準字S10980075，珠海億勝生物制藥有限公司)。

1.2 方法1.2.1 造模 參照付小兵等[5]全層皮膚缺損法經改進制成大鼠慢性難愈合創面模型。將40只大鼠隨機分為：空白組(急性全層皮膚缺損組)10只、對照組(慢性難愈合創面組) 30只。空白組大鼠根據模型建立方法在造模區行全層皮膚切除，但不注射氫化可的松；慢性難愈合創面組大鼠在造模區行全層皮膚切除后立即注射氫化可的松，制備慢性難愈合創面模型，造模成功后隨機分為模型組10只、美洲大蠊提取液組10只和貝復濟組10只，各組創面制備后即開始藥物干預，并每天換藥1次。

1.2.2 給藥 ①美洲大蠊提取液組：創面外敷兩層美洲大蠊提取液紗條(0.2 mL/cm2)，按創面大小剪成小塊貼于創面上，再加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。②貝復濟組：創面外敷兩層貝復濟浸透紗布(60U/cm2)，按創面大小剪成小塊貼于創面上，再加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。③模型組：創面外敷兩層生理鹽水紗布，按創面大小剪成小塊貼于創面上，加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。④空白組：備皮處外敷兩層生理鹽水紗布，按備皮面積大小剪成小塊貼于備皮處，加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定，不作其他干預。

1.2.3 取材 模型制備完成后，各組于 7 d、15 d共 2個時間點在4組分別隨機取 4只大鼠用 20%烏拉坦 5 mL/kg 腹腔注射麻醉后，取造模區創面組織，空白組取備皮處的相應部位全層皮膚，深達筋膜層。所取組織樣品在 4℃ PBS 清洗，投入 2.5%電鏡級戊二醛固定液，備透射電鏡觀察。 1.2.4 電鏡觀察 ①取材：組織塊約 1×1×3 mm3。②制片：首先2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定 2 h以上。用 0.1M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次 10～15 min，1%鋨酸固定液固定 1～2 h。用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次10～15 min。再脫水：50 %丙酮10～15 min ；70%丙酮 10～15 min；90 %丙酮 10～15 min；100%丙酮 15～20 min，中間更換一次。再浸泡、包埋：純丙酮+包埋液(1∶1)37℃ 12 h；純包埋液 37 ℃ 10～12 h。最后固化：37度烘箱內過夜，60 ℃烘箱內12～24 h。 超薄切片機切片 50～100 nm。③3 %醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色。④日立 H7700透射電鏡觀察、拍片。圖像采集均由中南大學湘雅醫院電鏡室代為完成。觀察各組傷口愈合處基底細胞的顯微形態。

1.2.5 橋粒定量分析 角質形成細胞之間借助橋粒互相連接，電鏡下可見中央層和附著斑，其上有張力微絲附著，橋粒的主要作用是維持細胞間的連接，能阻止溶液中的分子，特別是大分子沿著細胞間的縫隙滲入體內，維持細胞一個穩定的內環境。美洲大蠊提取物組在難愈合創面上促進傷口愈合優勢，研究組特意選取創面細胞中的橋粒作為觀察指標。創面肉芽組織選取第3、7、15天時4組標本各6例。橋粒定量采取10000倍下透射電鏡下觀察計算橋粒面積。

1.3 統計方法 采用統計學軟件 SPSS 18.0 進行統計學分析，計量資料以均數加減標準差表示，兩樣本間比較采用t檢驗，多樣本間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微絲、橋粒等超微結構 4組標本微絲、橋粒等超微結構，美州大蠊提取液組顯示最佳，貝復濟組次之，空白組更次，模型組最少。如圖1、圖2所示。

2.2 橋粒面積 應用透射電子顯微鏡，對24例標本橋粒面積統計，換藥第3、7、15天時，美洲大蠊提取液組、貝復濟組與空白組橋粒表達水平均明顯高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 透射顯微鏡觀察比較各組不同時期的橋粒面積表達水平 (nm,10000x)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

3.1 微絲、橋粒結構形態比較 美洲大蠊提取液組與其他組別比較，微絲密集，緊致，與空白組及模型組有差異；美洲大蠊提取液組創面新生細胞之間存在電子密度稍高的橋粒，與模型組及空白組比較有差異。表明美洲大蠊提取液加速創面新生細胞超微結構的形成，從而維持一個正常穩定的細胞內環境。

3.2 橋粒結構量化分析 正常新生細胞之間橋粒連接約20～25 nm，治療第15天時，美洲大蠊提取液作用下的創面細胞間的橋粒面積為(25.7±1.53) nm，連接結構近乎正常細胞間面積，貝復濟組橋粒面積為(23.3±2.06) nm，兩者差異不具有統計學意義(P>0.05)，與其他各組間差異性大，且隨著創面愈合時間越長，美洲大蠊提取液組與模型組及空白組之間差異越來越大，進一步表明橋粒的形成成功阻止溶液中大分子沿著細胞間的縫隙滲入體內，維持細胞一個穩定的內環境從而加速創面愈合。

創面的愈合涉及炎癥反應、白細胞、成纖維細胞、內皮細胞及上皮角質細胞等多種細胞的遷移、增殖和分化，細胞生長因子分泌，基質沉積等[6-7]，難愈合創面細胞的超微結構是潛在的創面愈合生長標志物，微絲(microfilament)是細胞運動的結構基礎，參與細胞分裂時收縮環形成，橋粒(bridge granule)多見于上皮，尤以復層扁平上皮細胞間較多，橋粒上有張力微絲附著，張力微絲是角蛋白的前身，它對保持細胞形態起重要作用，故橋粒對新生細胞的形態維持起重要作用。實驗結果提示美洲大蠊提取物對難愈合創面新生細胞的形成有著絕對優勢，也進一步證明美洲大蠊提取物通過增加微絲及橋粒的數量加速細胞分裂，加速肌肉收縮,使微絨毛,應變纖維，胞質環流以及加速細胞間連接，阻止溶液中大分子沿著細胞間的縫隙滲入體內，維持細胞一個穩定的內環境從而加速創面愈合。

[1]尹彬. 康復新聯合奧美拉唑、阿莫西林膠囊三聯療法治療消化性潰瘍療效分析[J].中外醫學研究，2010, 8(26)：17-18.

[2]劉宏宇. 保留灌腸治療放射性直腸炎48例療效觀察[J] . 中國醫學創新，2010，7(3)：29-29.

[3]伍偉明，金麗穎，王真權，等. 康復新液治療肛管難愈合創面的臨床研究[J].中醫藥導報，2015,21(22)：71-73.

[4]曾娟妮，劉筱，伍偉明，等. 美洲大蠊提取液對大鼠難愈合創面VEGF表達影響的研究[J].中國民族民間醫藥，2016,25(19):64-66.

[5]付小兵，孫同柱，盛志勇. 幾種用于創傷修復研究的動物模型[J].中華實驗外科雜志，1999,16(5):479-480.

[6]Bauer SM, Bauer RJ,Velazquez OC. Angiogenesis vasculogenesis and induction of healing in chronic wounds [J]. Vasc Endovasc Surg,2005,39(4)：293-306.

[7]Brusselaers N, Pirayesh A, Hoeksema H, et al. Serum replacement in burns [J]. J Trauma, 2010, 68(2): 490-501.