手足口病病原體EV71的檢測方法學比較

付 輝，安麗娜，彭碧波

近30年來，全球新發傳染性疾病達40余種，中國目前發現20多種[1]。傳染病的暴發對人類的生命健康會造成嚴重威脅，已成為災害救援醫學領域的研究熱點。其中，腸道病毒71型(enterovirus type 71，EV71)是人類腸道病毒之一，可通過糞口途徑或直接接觸感染者的呼吸道飛沫在人群中傳播[2]。EV71感染的臨床表現通常為手足口病(hand-foot and mouth disease，HFMD)，多感染5歲以下的兒童，受影響兒童經常出現3～4 d發燒和手、腳、肘、膝和頰黏膜等部位的皰疹[3]。在大多數情況下，這種疾病是溫和、自限的。然而，EV71感染有時會導致嚴重的神經系統疾病，如無菌性腦膜炎、腦炎、小兒麻痹癥樣癱瘓，甚至死亡。即便存活下來的患兒也會有神經系統后遺癥[4]。因此，對于HFMD病原體EV71的快速準確檢測對于臨床診斷治療尤為重要。本研究通過比較四種不同的方法對EV71感染的檢測，期望為臨床檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 非洲綠猴腎細胞(Vero)購自美國標準生物品收藏中心(American type culture collection，ATCC)，完全培養液為10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，1%雙抗(pen-strep)的MEM培養液，所有細胞均在含5% CO2的37 ℃ 孵箱中培養并傳代。病毒株EV71(H)株購自ATCC，于Vero細胞中傳代。

1.2 試劑耗材和儀器 一步法熒光定量試劑盒購自Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自QIAGEN公司，MEM液體培養液、青鏈霉素、胰酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和FBS購自Invitrogen公司，蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑購自Thermo公司，β-actin單抗和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗鼠二抗購自cell signaling公司，羊抗鼠綠色熒光二抗和免疫染色固定液購自碧云天生物技術研究所，EV71抗體購自Abnova公司。二氧化碳孵箱購自Thermo公司，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自Olympus公司，Bio-Rad濕轉系統和凝膠成像系統購自BIO-RAD公司，ABI 7500 Fast 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)儀，購自ABI公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)法測定50%組織細胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50) 將3×104個/孔的Vero細胞接種于96孔板內，待到細胞增長至75%的孔面積時，吸棄舊的培養液。將病毒原液按照10倍梯度依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。用不同稀釋度的病毒液100 μl/孔感染細胞1 h。1 h后吸棄病毒液，加入維持液100 μl/孔，將細胞放入37 ℃、5% CO2中繼續培養。觀察不同病毒濃度72 h的CPE，對觀察結果進行記錄。

將病毒感染細胞與正常細胞作對比，以細胞狀態改變或死亡比例分別標記為4(細胞死亡比例76%～100%)、3(細胞死亡比例51%～75%)、2(細胞死亡比例26%～50%)、1(細胞死亡比例0～25%)、0(細胞形態未發生變化或全部存活)，采用Reed & Muench方計算TCID50。

1.3.2 Real-Time PCR檢測 將9×105個/孔的Vero細胞接種于6孔板中，溫度37 ℃、 5% CO2孵箱中培養。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續培養24 h后，吸去細胞培養液，使用RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA，使用一步法熒光定量試劑盒進行RT-PCR檢測，特異引物序列見表1。25 μl反應體系，反應條件50 ℃ 3 min，95 ℃ 10 min，40個循環(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s)。采用Sybr-GreenER熒光檢測系統對目的基因進行相對定量分析， 采用看家基因β-actin作為內參照對Ct值進行歸一化處理，基因表達差異計算方法采用ΔΔCt法。實驗重復3批，每批次3個復孔。

表1 特異引物序列

1.3.3 Western blot檢測 將9×105個/孔的Vero細胞接種于6孔板中，37 ℃、 5% CO2孵箱中培養。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續培養24 h后，吸去細胞培養液，使用蛋白提取試劑提取細胞總蛋白后進行檢測。20 μg總蛋白上樣電泳后，轉膜至PVDF膜上，經5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入EV71一抗(1∶1000)和β-actin一抗(1∶1000)，室溫孵育2 h后經TBST洗脫，再孵育HRP標記羊抗鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h后經TBST洗脫顯影。

1.3.4 免疫熒光法檢測 將9×105個/孔的Vero細胞接種于6孔板中，37 ℃、 5% CO2孵箱中培養。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續培養24 h后，吸去細胞培養液，4 ℃ PBS洗3次。加入300 μl/孔固定液，固定10 min。4 ℃ PBS漂洗2次。加入0.5% Triton 穿孔15 min。4 ℃ PBS漂洗3次。1% BSA封閉1 h。TBST洗3次，加入含1% BSA的TBST稀釋的EV71抗體(1∶500)，于37 ℃雜交2 h。TBST漂洗3次，加入TBST稀釋的羊抗鼠熒光二抗(1∶500)，于37 ℃雜交1 h。TBST漂洗3次，觀察照像。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，不同感染量的病毒RNA改變水平的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TCID50測定結果 首先利用CPE法檢測EV71病毒毒力，病毒感染72 h后觀察記錄細胞病變見表2，經計算其TCID50為10-4。

2.2 Western blot檢測結果 如圖1所示，利用Western blot檢測EV71蛋白的表達，發現EV71感染24 h后即可檢測到明顯的病毒蛋白表達，并且病毒感染量越高， 檢測到的條帶越清晰。 而10-5感染量的病毒24 h無法檢測病毒蛋白的條帶。

表2 不同稀釋濃度手足口病病原體EV71病毒液感染校后72 h的CPE

注：CPE, 細胞病變效應；10-6、10-7和10-8組CPE觀察結果均記作0

圖1 手足口病病原體EV71感染24 h后各病毒量病毒蛋白的表達

2.3 免疫熒光法檢測結果 如圖2所示，利用免疫熒光法檢測EV71蛋白的表達，發現EV71感染24 h后即可檢測到明顯的病毒蛋白表達，并且病毒感染量越高，檢測到的熒光越多。而10-5感染量的病毒24 h只能檢測到較少熒光。

圖2 手足口病病原體EV71感染24 h后各病毒量病毒蛋白的表達

2.4 Real-Time PCR檢測結果 如圖3所示，采用Real-Time PCR檢測，可以靈敏地檢測到病毒RNA，即使其他方法檢測不到的10-5感染量，Real-Time PCR法也可以檢測到。

圖3 手足口病病原體EV71不同感染量病毒的RNA的水平

3 討 論

EV71于1969年首次從美國加州患者身上分離得到，隨后在全球范圍內多次暴發[5-9]。EV71感染引起的HFMD主要臨床癥狀為手、足和口腔黏膜的皰疹病變，少數重癥感染者還可引起腦炎、無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓炎等神經系統組織的病變，甚至死亡[10,11]。自2008 年以來，中國HFMD發病人數和死亡人數呈逐年上升趨勢，將會嚴重影響社會的穩定與發展[12]。對于EV71的早期、快速、準確診斷對于臨床治療十分重要，在病毒感染尚未對神經系統造成嚴重損害之前進行治療，防止神經系統后遺癥的發生對于兒童的成長發育至關重要。本研究通過對不同方法學的比較來研究適合不同情況EV71感染的診斷，旨在為臨床有效快速檢測和治療提供依據。

目前對于EV71的檢測有各種不同的方法，均有各自的優缺點，以便于EV71感染不同階段的檢測。本研究利用4種不同實驗方法對EV71的感染進行了檢測，發現4種方法都可檢測到EV71的感染，只是不同的方法對病毒感染量的敏感性不同，整個實驗周期也不同，對實驗人員的操作要求也不同。其中，CPE法是最容易、簡便的方法，但是實驗周期太長且靈敏度低。Western blot方法對于病毒感染量有一定要求，較低的感染量無法檢測病毒，但是相對于CPE方法全程至少96 h，Western blot法所需時間減少。免疫熒光法和Western blot法所需時間和檢測到的結果基本一致，對于病毒感染量同樣有一定要求，較低的感染量無法檢測病毒。Real-Time PCR是4種方法中最靈敏，同時也是最快速的方法，48 h即可完成檢測。因此，對于臨床就診的患者可以根據已經發病的程度選擇一種或幾種合適的方法對病原體進行快速、準確的確定，為臨床用藥治療提供依據。

除了本研究所利用的實驗方法，目前還有基因微陣列檢測[13]和酶聯免疫吸附法(enzyme linked imnnosoboynt assay,ELISA)兩種檢測方法，可用于EV71感染的測定，這兩種方法同樣有著各自優缺點。目前臨床上應用較多的還是Real-Time PCR和ELISA這兩種方法，隨著實驗技術的不斷創新，相信在不久的將來會有更多更加完善的適合臨床檢測的方法被應用到實踐中，為一線醫護工作者提供更好的診斷支撐，為HFMD的預防和治療提供更好的保障。

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