胃液固有熒光光譜在胃癌診斷中的應用進展

劉 健 閆秀娥 綜述 周麗雅 林三仁 審校

(北京大學第三醫院消化科，北京 100191)

針對胃癌診斷方法的探索，已歷經數十年的研究[1]。我課題組前期研究[2,3]表明，胃癌患者的胃液熒光光譜熒光強度較胃良性病變患者顯著增強，并建立了通過胃液熒光光譜區別胃癌與胃良性病變的方法。針對熒光增強現象機制的研究，先后從胃液中分離提取并鑒定出3個有價值且可用于胃癌及早期胃癌診斷和篩查的候選腫瘤標志物，即3種芳香族氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)[4,5]。本文對胃液熒光光譜及胃液熒光物質在胃癌診斷和篩查中的應用進展作一綜述，以期對提高我國早期胃癌的診治水平有所幫助，對廣大臨床和科研工作者有所啟發。

1 血清固有熒光光譜對胃癌的診斷價值

20世紀80年代，Leiner和Grigorovich等[6,7]分別分析了腫瘤患者與正常人之間血清熒光光譜的差異，試圖找到一種腫瘤診斷的新方法，但沒有取得滿意的結果。1990年以來，我課題組對血清和胃液熒光光譜在胃癌診斷中的應用價值進行了一系列研究。李成剛等[8]測定1191例胃內各類病變患者的血清固有熒光光譜，并分析胃癌患者血清熒光光譜的變化規律。結果表明，胃癌組血清第二熒光峰強度(fluorescence intensity of the second peak，P2FI)顯著高于胃內其他病變組(P<0.01)。但由于影響血清熒光光譜的干擾因素很多，特異性可能受影響，故改用胃液進行熒光光譜檢測，減少混雜因素，直接反映胃部情況[9]。

2 胃液固有熒光光譜對胃癌的診斷價值

胃液由胃黏膜上皮產生，并直接與胃黏膜上皮接觸，必定含有許多反映黏膜上皮代謝狀態的信息。當胃黏膜發生癌變后，代謝狀態也隨之發生變化，從而釋放一些內源性熒光物質，引起胃液熒光光譜發生變化[10]。王晶桐等[11]的研究共納入248例胃內各類病變患者，結果顯示胃癌與胃良性病變患者稀釋胃液的固有熒光光譜存在顯著差異：胃癌組胃液第一熒光峰強度(P1FI)顯著升高，而P2FI顯著減低。嚴海密和董琳等[12,13]的研究也證明胃液熒光分析對胃癌及癌前病變的診斷有一定的特異性。嚴海密等[12]收集881例胃良惡性疾病患者的胃液，用胃液熒光分析系統檢測胃液熒光強度，結果表明，以0.85(ROC曲線最佳臨界點)為判別標準，診斷胃癌的靈敏度為81.5%，特異度為78.7%，假陽性率為18.5%，假陰性率為21.3%；董琳等[13]收集980例胃良惡性疾病患者的胃液，同樣應用胃液熒光分析儀檢測胃液熒光強度，結果表明，以0.85為判斷標準，診斷胃癌的靈敏度為82.0%，特異度為79.2%。此外，診斷重度萎縮性胃炎伴腸化及胃黏膜不典型增生患者的判別標準與0.85相近。孫曉寧等[14]對胃癌高發地區人群進行大規模(1506例)隨機雙盲對照研究，胃液熒光光譜診斷胃癌的靈敏度、特異度和準確度分別為83.2%、80.7%和82.0%，提示這是一種可以用于胃癌臨床篩查的安全、簡便、經濟、有效的方法。

郭慧蘭等[15]以288 nm為激發光，檢測300～800 nm范圍內的胃液固有熒光光譜，比較胃癌與胃良性病變患者的胃液固有熒光光譜，再次證實，胃癌患者胃液P1FI較胃良性病變患者顯著增強(P<0.05)。當以P1FI≥39.0 AU(absorbance unit)為胃癌的診斷標準時，其用于胃癌診斷的靈敏度為85.0%，特異度為91.9%，準確度為90.8%。李淵等[16]對202例胃內各類病變患者的稀釋胃液進行固有熒光光譜分析，結果表明，胃癌與胃良性病變患者的固有熒光光譜峰位及峰數基本相同，而胃癌患者的胃液P1FI較胃良性病變患者顯著增強(圖1)。

圖1 胃良性病變(a)和胃癌(b)患者稀釋胃液固有熒光光譜[16]注：FI：熒光強度；P1F：第一熒光峰；P2F：第二熒光峰；P3F：第三熒光峰

孟靈梅等[17]的研究表明，稀釋濃度為1∶20、磷酸鹽緩沖溶液pH值為11.0、液氮保存不超過1個月時，胃液固有熒光光譜檢測結果較好。張月寧等[18]應用上述標準化檢測方法，對118例胃內各類病變患者的稀釋胃液進行固有熒光光譜檢測，根據ROC曲線進行分析，當選取PlFI≥78.5 AU為診斷標準時，其用于胃癌診斷可獲得較好的靈敏度(77.4%)和特異度(78.8%)。

3 胃液固有熒光光譜聯合其他檢查對胃癌的診斷價值

徐志潔等[19]的研究表明，在45歲以上的受檢者中，以P2FI≥111.8 AU或胃液pH值≥5.0作為胃惡性病變的判定標準，其診斷胃癌的靈敏度為83.3%，特異度為71.4%。閆秀娥等[20]在檢測稀釋胃液固有熒光光譜的基礎上，采用甲基化特異性PCR的方法對p16基因啟動子區域和死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)基因的甲基化狀態進行檢測，結果表明，p16和DAPK基因甲基化與稀釋胃液固有熒光光譜檢測結合后診斷胃癌的靈敏度和特異度分別提高到95.6%和97.8%，提示胃液固有熒光光譜和DNA甲基化狀態聯合檢測對胃癌診斷具有良好的臨床應用價值。

4 胃液高效液相熒光光譜對胃癌診斷和篩查的應用價值

高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是20世紀70年代迅速發展起來的一種物理化學分離分析技術，具有分離分析效能高、速度快、檢測靈敏度高等優點，是目前在國際分析化學界各種色譜模式中應用最廣、發展最快的領域。液相色譜-質譜聯用技術使液相色譜的高分析能力和質譜的高鑒定能力相結合，對復雜樣品體系特別是生物醫學領域的研究提供了更加有效的方法。

郭慧蘭等[21]應用HPLC法對251例胃內各類良惡性病變患者的稀釋胃液高效液相熒光光譜進行檢測，包括進展期胃癌39例、重度異型增生1例和胃內各類良性病變211例，結果顯示，P1FI用于診斷進展期胃癌先驗概率的靈敏度為92.5%，特異度為92.4%；后驗概率的靈敏度為85.0%，特異度為89.1%。張月寧等[22]應用Mono Q離子交換HPLC法檢測稀釋胃液高效液相熒光光譜，比較早期胃癌與胃良性病變患者間胃液熒光峰的差異。結果表明，于保留時間30～32 min之間規律出現一個強度最大的熒光峰，早期胃癌組該熒光峰強度的平均值顯著高于胃良性病變組(P<0.001)。建立ROC曲線，取0.12 V為界值，診斷早期胃癌的靈敏度為91.2%，特異度為87.8%，準確度為89.3%，提示HPLC法對早期胃癌也具有較高的診斷價值。盡管胃癌患者的胃液具有特異性熒光光譜，但引起胃液熒光光譜改變的內源性熒光物質尚待明確。

5 胃液熒光物質的鑒定及其對胃癌診斷和篩查的應用價值

質譜(mass spectrum，MS)技術是一種常用的定性分析工具，可用于獲取各種化合物的結構信息，如化合物的精確分子量、元素組成和序列、分子結構等。在生物樣品分析中，應用高效液相色譜與質譜聯用，可充分發揮高效液相色譜的分離功能和質譜的質量結構分析功能，進行蛋白質和多肽的序列分析、多糖的結構測定及寡核苷酸、核酸的分析等。

為從胃癌患者胃液中發現特異性熒光物質，并探討其作為胃癌診斷標志物的潛能，李淵等[23]收集10例胃癌和10例非胃癌患者的胃液，濃縮后進行高效液相熒光光譜分析，并收集高效液相熒光光譜中保留時間在11.5～12.5 min范圍內的熒光物質，再經質譜鑒定，觀察到L-色氨酸或其結構類似物可能是參與產生胃良惡性病變患者間胃液熒光光譜差異的物質。馬東杰和廉偉等[24,25]的研究進一步支持了這一結果，胃癌組(n=38)有52.6%的患者胃內容物中色氨酸濃度>6.0 mg/L，而在胃良性病變組(n=48)中僅有22.9%的患者胃內容物中色氨酸濃度>6.0 mg/L，2組相比差異顯著(P<0.05)。Abasov和Segawa等[26,27]也分別應用放射性紙層析法和HPLC法在胃癌患者的胃液中檢測到2種和3種AAAs濃度異常升高。

張月寧等[28]應用正交加速電噴霧串聯質譜(ESI-MS/MS)技術分析13份胃液標準品中的物質成分，結果得到13種多肽，經過比較，在現有數據庫中未發現與人同源的蛋白質多肽片段。但這13條肽段中均含有發色基團酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或含有苯環的脯氨酸。因為這些肽段含有2個以上AAAs，結構致密且距離較近，有利于共振能量的互相傳遞，造成原子核外離子對發生π-π躍遷，所以可以使熒光增強[29]。

鄧凱等[4]應用HPLC法對胃良惡性病變患者的胃液熒光光譜進行檢測并比較，確定4個差異性色譜峰，對應的色譜柱保留時間分別為8、12、16.5和33.5 min。定性研究結果表明，在液相色譜串聯質譜(LC/MS)分析中，這4個差異性色譜峰的單分子離子的質核比(mass to charge ratio，m/z)分別為182、166、205和265。同時檢測它們的子離子譜，上述4個分子的化學成分被解析為酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和丁卡因。該解析結果經磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)分析再次確認。此外，AAAs標準品在色譜柱中的保留時間也與這些差異性色譜峰相吻合。丁卡因是用于胃鏡檢查前鼻和咽喉部黏膜表面麻醉的麻醉劑，所以不作為內源性熒光物質繼續研究。隨后，鄧凱等進行了一系列的定量研究，以探討3種胃液AAAs作為胃癌診斷和篩查潛在生物標志物的可行性。鄧凱等[3]收集101例胃良惡性病變患者(胃癌33例，胃良性病變68例)的胃液標本，應用HPLC法檢測胃液中三種AAAs的含量。胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的濃度分別為胃癌組(54.9±11.0)、(54.3±11.4)和(19.4±4.7)μg/ml，胃良性病變組(8.7±2.6)、(8.8±2.1)和(2.7±1.0)μg/ml。與胃良性病變組相比，胃癌組患者胃液中3種AAAs的濃度均顯著升高(P值均<0.01)。應用ROC曲線分析胃液3種AAAs濃度異常升高判別胃癌與胃良性病變的價值，ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為酪氨酸0.838，苯丙氨酸0.856，色氨酸0.816(P值均<0.001)。為進一步探討3種胃液AAAs濃度異常升高對早期胃癌的判別價值，鄧凱等[5]收集49例早期胃癌和70例胃良性病變患者的胃液標本，并應用HPLC法檢測胃液中3種AAAs的濃度。結果表明，早期胃癌組中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的濃度較胃良性病變組均顯著升高(P值均<0.01)。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸濃度的中位數(P25～P75)分別為早期胃癌組19.4(5.8～72.4)、24.6(11.5～73.7)和8.3(2.1～28.0)μg/ml，胃良性病變組3.8(1.7～7.5)、5.3(2.3～9.9)和1.0(0.4～2.8)μg/ml。使用ROC曲線分析胃液3種AAAs濃度異常升高區分早期胃癌與胃良性病變的價值，AUC分別為酪氨酸0.790(95%CI0.703～0.877，P<0.001)，苯丙氨酸0.831(95%CI0.750～0.911，P<0.001)，色氨酸0.819(95%CI0.739～0.900，P<0.001)。運用ROC曲線對應的理想界值(酪氨酸≥18.8 μg/ml，苯丙氨酸≥9.6 μg/ml，色氨酸≥5.5 μg/ml)判別早期胃癌，其敏感度、特異度和準確度分別為酪氨酸51.0%、94.3%和76.5%，苯丙氨酸79.6%、74.3%和76.5%，色氨酸61.2%、94.3%和80.7%。上述研究結果提示胃液AAAs濃度從胃癌發生的早期就開始升高，可能是胃癌發生的早期事件。由此推測，胃液AAAs可以用作判別早期胃癌的生物標志物。上述研究成果得到2篇綜述的大幅引用[30,31]，它們分別發表在蛋白質組學研究領域國際權威期刊Journal of Proteomics和腫瘤學研究領域國際權威期刊Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention上。

劉健等[32]建立并驗證基于男女性別比、胃液pH值和AAAs濃度的胃液指數模型。使用該模型診斷胃癌的AUC為0.897(95%CI0.838～0.956)，理想界值、靈敏度、特異度和準確度分別為8.995、83.9%、82.0%和82.5%。更重要的是，該模型也適用于早期胃癌的診斷，其AUC為0.848(95%CI0.771～0.924)。

綜上所述，胃良惡性病變患者的胃液固有熒光光譜、高效液相熒光光譜和游離芳香族氨基酸濃度之間存在顯著差異，用于胃癌診斷和篩查的靈敏度、特異度和準確度均較高，有望成為一種安全、有效、簡便、經濟的胃癌診斷和篩查方法。

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