早發型重度子癇前期中ADMA與DDAH2的表達水平及臨床意義

趙莉娜 李嘉蔚 劉國成

[摘要] 目的 探討早發型重度子癇前期患者血清及胎盤組織中非對稱二甲基精氨酸（ADMA）和二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）的表達及其之間的相關性，揭示二者在疾病發生發展中的作用機制，從發病機制方面尋求疾病早期診療依據。 方法 選取2017年1月～2018年1月于廣東省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）住院的45例重度子癇前期孕婦作為實驗組，其中早發型重度子癇前期組25例、晚發型重度子癇前期組20例。選擇同期在我院待產的35名健康孕婦作為對照組。采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清中ADMA與DDAH2的表達水平及免疫組化SP法檢測兩組胎盤組織中ADMA與DDAH2的表達水平。采用Spearman線性相關分析進行相關性分析。 結果 外周血清中，ADMA在早發型重度子癇前期組中的表達水平顯著高于晚發型組及對照組（P < 0.05）;晚發型重度子癇前期組顯著高于對照組（P < 0.05）;早發型重度子癇前期組顯著低于晚發型組及對照組（P < 0.05）;晚發型重度子癇前期組顯著低于對照組（P < 0.05）。在胎盤組織中，早發型重度子癇前期患者ADMA陽性染色率顯著高于晚發型組（P < 0.05），晚發型重度子癇前期組顯著高于對照組（P < 0.05）;早發型重度子癇前期組顯著低于晚發型組（P < 0.05），晚發型重度子癇前期組患者胎盤組織中DDAH2陽性表達率顯著低于對照組（P < 0.05）。早發型重度子癇前期組患者DDAH2與ADMA在外周血清及胎盤中表達呈顯著負相關（r = -0.77，P < 0.05）。 結論 早發型重度子癇前期患者外周血清及胎盤組織中ADMA表達水平顯著升高，DDAH2顯著下降，且兩者呈負相關性。提示ADMA和DDAH2與早發型重度子癇前期發病密切相關。兩者可能通過作用血管內皮細胞損傷，影響滋養細胞浸潤，參與早發型重度子癇前期疾病的發生和發展。

[關鍵詞] 早發型重度子癇前期;滋養細胞;ADMA;DDAH2

[中圖分類號] R714.244 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2018）12（c）-0071-05

[Abstract] Objective To discuss the expression of ADMA and DDAH2 in plasma and placental and the correlation between the two factors in early onset severe preeclampsia （EPSP）. To approach the possible role of DDAH2 and ADMA in the pathogenesis and progression of EPSP. And to seek the basis of early diagnosis and treatment of disease based on pathogenesis. Methods From January 2017 to January 2018， 45 cases with severe preeclampsia in Guangdong Maternal and Child Health Hospital （"our hospital" for short） were selected as the experimental group， of which 25 cases in early onset severe preeclampsia group， 20 cases in late onset severe preeclampsia group， and 35 healthy pregnant women delivery in our hospital during the same period were selected as the control group. The expression levels of ADMA and DDAH2 in sera and placenta tissues of two groups were detected with Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Spearman linear correlation analysis was used for correlation analysis. Results The expression level of ADMA in serum of early-onset severe preeclampsia was significantly higher than that of later onset severe preeclampsia and control group （P < 0.05）. The expression level of ADMA of later onset severe preeclampsia in serum was significantly higher than that of control group （P < 0.05）. The expression level of DDAH2 of in serum of early onset severe preeclampsia group was significantly lower than that of later onset severe preeclampsia group and control group （P < 0.05）. The expression level of DDAH2 in serum of later onset severe preeclampsia group was significantly lower than that of control group （P < 0.05）. The positive staining rate of ADMA in the placenta tissues of early onset severe preeclampsia was significantly higher than that of late onset severe preeclampsia （P < 0.05）. The positive staining rate of ADMA in the placenta tissue of late onset severe preeclampsia was significantly higher than that of control group （P < 0.05）. The positive staining rate of DDAH2 in the placenta tissues of early onset severe preeclampsia was significantly lower than that of late onset severe preeclampsia （P < 0.05）. The positive staining rate of DDAH2 in the placenta tissues of late onset severe preeclampsia was significantly lower than that of control group （P < 0.05）. The expression levels of DDAH2 and ADMA in serum and in the placenta tissues of earlyonset severe preeclampsia appeared in a obvious negative correlation （r = -0.77， P < 0.05）. Conclusion The significantly higher expression level of ADMA and the significantly lower expression level of DDAH2 in serum and in the placenta tissue of early onset severe preeclampsia， they are negatively correlated. ADMA and DDAH2 are closely related to early onset severe preeclampsia. They may interact with each other in the process of trophoblast infiltration and participate pathogenesis of the early onset severe preeclampsia.

[Key words] Early onset severe preeclampsia; Trophoblast cells; ADMA; DDAH2

目前我國妊娠期高血壓高發，已成為衛生事業急需解決的難題之一，提早干預，有效防范疾病的發生，減輕臨床癥候群及不良預后，保障母嬰安全具有重要意義[1]。早發型重度子癇前期發病早，病情重，威脅母嬰健康，發病機制更傾向于通過影響胎盤血管重塑，引發的胎盤源性疾病，以母胎界面免疫耐受異常、血管內皮細胞激活和損傷，重塑障礙為目前研究熱點[2]。一氧化氮（NO）作為內源性血管舒張因子，表達異常及活性降低可導致血管內皮功能活性失調和疾病的發生息息相關[3]。

內源性抑制物非對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）和二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylamine hydrolase，DDAH）在通過影響酶的活性來調節NO的表達生成，在血管內皮激活與損傷的發生發展中起重要作用。晚發型發病晚，程度輕，發生過程更傾向于母體性疾病，是長期以來機體與疾病耐受平衡失調的過程。

本研究通過研究早發型重度子癇前期患者血清及胎盤組織中ADMA與DDAH2的表達異常及兩者相關性，從影響NO合成及活性表達機制，與內皮損傷和/或激活等相關方面探討ADMA與DDAH2異常分泌與疾病發展變化的關系，以及兩因子在內皮損傷，免疫遺傳因素方面所起的作用，以期為早發型重度子癇前期的早期診治提供新的依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年5月～2017年5月在廣東省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）住院并符合入組條件的孕婦80例作為研究組。三組的入組條件：①符合診斷標準[4];②單胎初產婦;③剖宮產終止妊娠。排除標準：伴有原發性高血壓、心血管病、糖尿病、內分泌疾?。ㄈ缂谞钕俟δ墚惓＃?、肝腎疾病等合并癥。研究組包括25例早發型重度子癇前期組（≤34周）和20例晚發型重度子癇前期組（>34周）;另外同期在我院待產的35名健康孕婦作為對照組。子癇前期的診斷標準參考第8版《婦產科學》[4]，早發型組平均年齡（29.1±2.6）歲，平均孕齡（32.2±1.5）周;晚發型組平均年齡（28.8±3.3）歲，平均孕齡（36.4±1.1）周;對照組平均年齡（28.9±2.1）歲，平均孕齡（37.5±2.8）周。三組年齡、孕齡差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 樣本的采集和檢測

1.2.1 血清胎盤樣本的收集 ?實驗組住院后未經藥物治療，采集兩組空腹肘靜脈血約6 mL，室溫下放置30 min，后置于4℃，離心機的離心半徑為22.5 cm，2500 r/min離心15 min，分離血清，保存在-70℃冰箱凍存待測。胎盤標本：胎盤娩出后即刻取近臍帶處避開鈣化點及血管密集區，取胎盤組織約1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm大小，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，用液氮短暫冷凍后保存在-70℃冰箱待測。

1.2.2 血清ADMA與DDAH2的檢測 ?采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試驗對象血清中ADMA和DDAH2的濃度，ADMA試劑及DDAH2試劑分別購自廣州一科生物有限公司（生產批號：20170806）和武漢博士德公司（生產批號：20170713）。具體步驟嚴格按照說明書依次進行標準品稀釋、加樣、溫育、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、測定。

1.2.3 胎盤組織ADMA與DDAH2的表達 ?采用免疫組化SP法。取各組胎盤標本，包埋、切片、脫蠟，3%過氧化氫滅活內源性酶，修復抗原，加山羊血清封閉液，第一抗體，漂洗后依次滴加生物素化二抗（IgG）和SABC試劑，DAB顯色，蘇木精復染。結果判定：胎盤滋養細胞、血管內皮細胞的細胞核上呈現棕黃色染色為陽性，無著色或與背景顏色一致為陰性;參照Fromowitz綜合計分法[5]，根據切片中棕黃色陽性細胞的數量比例及染色信號的強弱進行判斷：A、按陽性細胞百分率計分：陽性細胞數<l%為0分，陽性細胞數1%～25%為1分，陽性細胞數>25%～50%為2分;陽性細胞數>50%為3分;B、按染色信號強弱計分：未染色為0分，淡黃色為1分，黃色2分，棕黃色為3分;將A、B綜合統計得分相乘，結果分4組：0分為陰性（-），1～3分為弱陽性（+），4～6分為陽性（++），9分為強陽性（+++）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;關性分析采用Spearman相關分析;以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組外周血清中ADMA和DDAH2水平比較

外周血清中ADMA在早發型重度子癇前期組表達水平均顯著高于晚發型重度子癇前期組和對照組（P < 0.05）;血清中ADMA水平在晚發型重度子癇前期組顯著高于對照組（P < 0.05）。此外，外周血清中DDAH2表達水平在早發型重度子癇前期組表達水平顯著低于晚發型重度子癇前期組及對照組（P < 0.05）;而晚發型重度子癇前期組外周血清中DDAH表達水平顯著低于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.2 三組胎盤ADMA和DDAH2表達率比較

早發型重度子癇前期組胎盤組織中ADMA陽性表達率顯著高于晚發型重度子癇前期組及對照組（P < 0.05），晚發型重度子癇前期組胎盤組織中ADMA陽性表達率顯著高于對照組（P < 0.05）。見表2。早發型重度子癇前期組胎盤組織中DDAH2陽性染色率顯著低于晚發型重度子癇前期組（P < 0.05），晚發型重度子癇前期組胎盤組織中DDAH2陽性染色率顯著低于對照組（P < 0.05）。見表3。

2.3 ADMA/DDAH2在血清中表達的相關性分析

Pearson相關系數分析顯示，早發型重度子癇前期患者血清中ADMA表達水平與DDAH2呈負相關（r = -0.77，P < 0.05）。

3 討論

ADMA是一種內源性NOS抑制劑，可抑制NOS的活性，減少NO的合成，廣泛分布于血漿、血管內皮細胞、肝臟、腎臟組織及體液中，是體內各種多肽L-精氨酸殘基發生甲基化和水解而釋放的蛋白代謝物，血漿中AMDA主要經DDAH水解代謝而失活。動物和人體試驗均顯示ADMA表達異常與重度子癇前期的胎盤血管收縮異常密切相關[6]。研究發現高脂喂食母鼠，其雄性子代腸系膜動脈DDAH2表達下降，DDAH2/ADMA/eNOS/NO通路異常表達[7]，NO生成減少，血管舒張/收縮平衡失調，導致血壓增高。高濃度ADMA作用下大鼠血管內皮功能遭到破壞，舒縮功能紊亂，引發血壓升高[8]。糖脂代謝紊亂患者血漿中ADMA高表達，高糖刺激氧化應激增強，血管舒縮紊亂，導致血壓升高，血漿中L-精氨酸替代ADMA可逆轉內皮損傷誘發的高血壓[9]。文獻報道子癇前期患者血中ADMA表達水平在臨床癥狀出現前就顯著升高[8]。Seppa[10]在并發早發型重度子癇前期10周前血清ADMA濃度顯著升高，認為ADMA高表達是作為高血壓發病的預警。給外源性NOS抑制劑后，哺乳動物可出現類似子癇前期的臨床表現[11]。

本研究結果顯示血清中ADMA水平在三組間差異有統計學意義（P < 0.05），ADMA在早發型重度子癇前期組血清中明顯高表達，與以上研究結果相符，推測其可能的作用機制如下：①ADMA過度表達可以通過調節L-精氨酸/eNOS/NO通路，競爭性的抑制eNOS生物活性，同時作為轉運體的競爭性抑制劑干擾L-精氨酸細胞轉運，使內源性NO生成減少，影響內皮依賴性血管舒張功能和內皮保護作用[12-13]，造成血管內皮損傷，功能障礙，破壞機體血流動力學水平[14]，誘發子癇前期發生。②ADMA還可抑制抗氧化物質分泌如SOD、GSH-Px、CAT、SVCT，促進炎癥介質、氧自由基分泌，造成胎盤中滋養細胞及內皮細胞氧化損傷外，還會激活凋亡程序誘導滋養細胞凋亡[15-16]，造成胎盤滋養細胞淺著床，誘發子癇前期發生。近年來缺乏對胎盤AMDA的表達水平的系統性研究，本研究結果顯示，ADMA在早發型重度子癇前期患者胎盤組織中高表達，推測胎盤組織高分泌ADMA，通過胎盤勻漿，彌散到外周血管組織，通過以上血管損傷，滋養細胞凋亡等作用機制發揮作用，引起血管內皮細胞受損，打破母胎界面免疫耐受平衡，同時參與滋養細胞凋亡，胎盤血管完整性受損，絨毛發育異常，相繼引發早發型重度子癇前期的各種病變，檢測孕婦體內ADMA水平也許可以作為反應胎盤功能的一項指標。

DDAH2是一種胞質蛋白酶，可降解人體內90%的ADMA，主要分布于血管內皮細胞，妊娠后DDAH2主要于心血管和胎盤組織中[17]，其基因的多態性與ADMA表達水平及活性相關。高血壓、高血脂和糖尿病患者的血漿中DDAH2的低轉錄、低表達和活性減弱與ADMA表達增加密切相關。研究發現離體血管導入hDDAH2重組腺病毒，發生粥樣硬化的家兔血管中DDAH2的表達水平提高，活性增強，使內皮舒張功能加強，降低全身血壓[18]。

本研究通過免疫組織化學法檢測各組胎盤中DDAH2表達主要位于胎盤內皮細胞核上，其染色率在早發型重度子癇前期組表達明顯下降，正常妊娠胎盤組織高度表達DDAH2，可能參與清除胎盤ADMA，減少內皮損傷，維持血壓穩定。早發型重度子癇前期組血清及胎盤DDAH2表達明顯下調，降解ADMA能力受限，ADMA在體內聚集，推測其作用機制：通過影響ERK1/2-CREB信號通路，競爭內皮細胞eNOS，使其表達下調及降低NO生成，體內收縮因子/舒張因子平衡失調，加重胎盤血管內皮細胞損傷及提高全身微小血管的緊張性。另外，子癇前期合并高糖高脂等糖脂代謝紊亂可抑制DDAH的活性，NO合成減少，內皮依賴性血管舒張作用減弱，促使血壓升高[19]。

綜上所述，早發型重度子癇前期血清及胎盤組織中ADMA表達顯著升高，DDAH2表達顯著下降，兩者影響內皮損傷和胎盤缺血學說的原因之一，故本研究著手于胎盤源性方面深入探討早發型重度子癇前期相關病理生理改變。通過對ADMA與DDAH2在各組孕婦血清胎盤中差異表達分析，推測兩者異常表達與胎盤血管內皮損傷，母胎免疫失衡，子癇前期的病理生理密切相關，可能成為早發型重度子癇前期病變的干預靶點和觀測指標;深入研究ADMA與DDAH2基因多態性與早發型重度子癇前期的關系，可以從基因診斷和基因治療角度進一步為子癇前期的早期診斷評估治療等方面提供新的理論依據。尋找基因干預靶點，從基因水平活化或滅活ADMA與DDAH2蛋白活性，可能為疾病治療提供新的臨床思路。

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（收稿日期：2018-04-20 ?本文編輯：任 ? 念）