茶花“赤丹”組織培養芽誘導增殖技術研究

俞建妹 劉芳 劉玉軍 沈遐 盧德陽

摘要：指出了對茶花“赤丹”進行組織培養，有利于芽誘導的外植體為一級分枝，通過試驗得出：較理想的芽增殖培養基為ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L，增殖系數可達6.7。

關鍵詞：茶花“赤丹”;組織培養;芽誘導;增殖

中圖分類號：S722.8 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2018）11-0060-03

1 引言

茶花“赤丹"（Camellia japonica‘Chidan）是山茶的一個品種，屬常綠灌木和小喬木，原產自中國華東地區，花朵碩大、艷麗、多變、活潑。但此品種較容易產生芽變，已形成一個龐大的“赤丹”系家族，其典型的突變品種有“粉丹”、“玉丹”、“鴛鴦鳳冠”、“鳳還巢”、“百萬富翁”和“醉楊妃”等，皆具有很高的觀賞價值。本研究的茶花“赤丹”花大紅色，花瓣70多枚，呈8～9輪排列，花瓣質地厚，中型花，直徑10cm，完全重瓣型，為茶花珍品，常被茶花愛好者所青睞。為了能保持該種的優良遺傳穩定性，規模化培育其苗木應用于花卉市場，利用高科技的組織培養技術是最有效的途徑。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗材料來源于良鳳江國家森林公園（南寧樹木園）。以8年生，常年開花，花量大、花色艷麗的“赤丹”單株為對象，選擇根兜基部萌發的半木質化或剛木質化，生長健壯的芽條作為外植體。

2.2 方法

2.2.1 外植體滅菌消毒

采集根兜萌芽條上一級、二級、三級半木質化或剛木質化的枝條為外植體。在連續放晴3d以上的氣候采集枝條，首先剪去枝條的葉片，浸泡于5%洗衣粉溶液中，同時用軟毛刷輕輕擦洗表面污垢，流水沖洗30min，將剪成長約5cm（至少帶1個腋芽）的莖段，用75%乙醇處理30s，無菌水清洗3次后，0.1%HgCl₂溶液浸泡15min，無菌水沖洗4～6次，每次2～5min，切除莖段兩端受傷組織，接種于啟動培養基ER中。每級分枝接種100顆莖段，統計接種后第6～30d的外植體污染率和褐化率。

2.2.2 始芽誘導培養

張建華[1]等研究發現，ER培養基比較適合茶花樹組織培養，因此，本試驗始芽誘導基本培養基選擇ER，6-BA、KT、ZT為芽誘導試驗的細胞分裂素。將上述3種級數的無菌外植體分別接種于①ER+6-BA2.0mg/L+IAA0.5mg/L、②ER+KT1.0mg/L+IAA0.5mg/L、③ER+ZT0.5mg/L+IAAO.5mg/L的培養基內。每種培養基接種每級數外植體20瓶，每瓶接種外植體1顆，3次重復。觀察記錄外植體始芽萌發時間、數量及其芽形態特征。

2.2.3 芽增殖培養

本試驗采用L9（34）方法，設計4個因素（基本培養基、6-BA、IAA、CH），每個因素3個水平，共9個處理，每個處理接種20瓶，每瓶接芽1顆，3次重復，培養50d統計新芽增殖數量，計算各處理芽增殖系數。

2.2.4 葉片黃化的遏制

在繼代芽培養過程中常出現芽葉片黃化至死現象。根據芽的葉片黃化特點，開展①添加VC（抗壞血酸）10mg/L，②使用有濾網的封口膜、③調節培養基pH值等試驗，每個處理接種20瓶，每瓶接芽5顆，3次重復，連續培養三周期，統計芽葉片黃化狀況。每周期30d。

2.3 培養條件

試驗除外，所有的培養基均附加白糖30 g/L，瓊脂5g/L，pH值為6.0。培養基在1.1mp，120℃高溫高壓條件下滅菌消毒20min。培養室溫度23℃±2℃，光照時間12～14h/d，光照強度800～3000Lx。新轉接的培養物，在800Lx光照條件下培養7～10d。

2.4 數據分析方法

試驗數據采用Excel 2013、SPSS18.0進行數據統計及顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 不同級數枝條滅菌的效果

連續15d采集萌芽條一級、二級、三級半木質化或剛木質化枝條進行滅菌消毒試驗，枝條滅菌消毒效果統計：一級分枝不污染率70%;二級分枝不污染率61%;三級分枝不污染率55%。由此得知，一級分枝較于二級、三級分枝枝條的污染率低9%～15%。一級分枝離主桿最近，養分充足，生長健壯，體內營養運輸快，新陳代謝旺盛，在相同濃度相同殺菌劑的條件下，對殺菌劑傷害的抵抗力較強，加速了傷口自我愈合速度，以降低褐化枯死率，較多地獲取無菌活體，能為下一步外植體芽誘導提供較豐富的試驗材料。因此，一級枝條是滅菌消毒首選的外植體。

3.2 枝條級數與細胞分裂素對始芽誘導的影響

從表1可知，參試的細胞分裂素，在同一種類同一濃度條件下，芽誘導率大小排序為一級枝條>二級枝條>三級枝條。一級枝條始芽萌發需要的時間也最短，添加ZT的培養基，僅培養21d始芽萌發了，所以選擇一級枝條作外植體，有利于始芽的誘導，加快芽培養速度。此原因可能在于一級枝條直接萌發于主干。發育早期的組織細胞轉化能力較強，而發育晚期的組織細胞轉化能力較差，甚至無轉化能力[2]。在細胞分裂素對腋芽誘導及生長的影響中可知，KT、ZT與6-BA對一級側枝誘導芽作用存在顯著性差異。KT與ZT較6-BA更容易促進始芽萌發，但芽不健康。因此，適宜芽萌發的激素種類和濃度不一定適宜芽的生長。為了培育生長健壯的芽，利于下一步芽增殖培養，綜合始芽誘導率和芽形態特征表現，篩選出6-BA是比較適宜山茶“赤丹”外植體始芽誘導的細胞分裂素和濃度。

3.3 不同培養基配方對芽增殖效果的影響

從表2可知，6-BA對芽的增殖起主導作用。芽的增殖系數隨著6-BA濃度的遞增，總體呈向上趨勢，處理9除外，處理3和處理6芽增殖系數為高，分別是8.0和7.0。其次是處理2、處理5和處理8，芽增殖系數在5以上。但處理3和處理6的叢芽均出現不同程度的玻璃現象，而處理2和處理5的叢芽生長正常。原因可能是培養基中6-BA濃度為5.0mg/L，對山茶“赤丹”的莖尖和分生組織的細胞分化和生長刺激作用過大，加上在培養基中添加了營養豐富的CH，使培養物直接增殖不定芽形成試管苗的進程快、時間短，部分分生組織還沒能來得及適應新的環境[3]，而導致細胞分化受損，細胞質稀薄、細胞壁發育不良之故。CH對不定芽的分化和生長具有較強的促進作用，在含較高6-BA的培養基中添加CH濃度不宜過高。處理2和處理5中BA2.5mg/L，分別添加CH250mg/L和100mg/L，芽增殖系數雖然比處理3和處理6的分別低19.400，4.4%，但分化出的叢芽生長健康。本試驗采用的3種基本培養基，在適宜的6-BA和CH濃度條件下均能使增殖芽健康生長。為了能培育出較多的健壯芽用于進一步芽擴繁及生根，綜合考慮芽的增殖系數及生長情況，挑選出相對較優的增殖配方為處理2。

3.4 不同方法對組培芽葉片黃化遏制效果的影響

一般情況下，茶花“赤丹”繼代芽培養到第6代時葉片出現黃化至枯死現象，為了改善或遏制此現象，根據茶花自然生態習性，將繼代了5代的“赤丹”增殖芽分別轉接到：①添加Vc10mg/L，②使用有濾網的封口膜封口，③調節培養基pH值到5.5這3種不同處理方法的培養基內培養，連續培養3代，結果表明：第3種方法對培養物葉片黃化或褐化現象未得到良好的改善。添加Vc10mg/L的培養基中葉片黃化現象得到了有效的控制，新長出的葉片第二代培養時已沒有出現局部黃化或褐化現象，第三代培養時，芽得到正常生長。Vc是一種廣泛分布在植物中的維生素，在植物體內參與電子傳遞系統中氧化還原作用，促進植物新陳代謝[4]，提高植物抵抗干旱、臭氧和紫外線作用。完整植株是能夠制造維生素的，但是離體卻不能合成足夠的維生素[5]。可能是隨著“赤丹”繼代芽生長速度的加快，Vc的合成不能滿足生長的需求，新陳代謝減弱而導致芽的葉片黃化。使用有濾網的封口膜能增加瓶內氧氣輸人，促進芽的新陳代謝，葉片黃化程度有所改善，但其效果次于添加Vc的。所以，為了培養健康的增殖芽，宜在培養基內添加Vc10mg/L或培養容器使用有封口膜的瓶蓋，能比較有效地遏制繼代芽葉片黃化現象。

4 結論與討論

根兜萌芽一級分枝滅菌消毒效果較好，且開始萌芽時間短。其是最佳始芽誘導的細胞分裂素，濃度為6一BA2.0mg/L，萌芽率高且始芽健壯，能有效地接種入芽增殖培養基為ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L中，叢生芽生長快速，有側芽萌發，增殖系數可達6.7，且能遏制或改善增殖芽葉片黃化枯死現象，能滿足生產化育苗需要，進行產業化生產。

適宜始芽誘導6-BA濃度低于芽增殖培養的濃度，原因可能是外植體來源于一級分枝幼嫩組織，養分充足，細胞活躍，分裂能力強，本身含有較高的生長激素水平，所以不需添加太多的外源激素，不定芽便能快速萌發。在瓶苗培養過程中出現黃化現象是否是培養物合成VC量不能滿足自己生長需求，引起自身氧化還原效率低，新陳代謝緩慢而引起葉片黃化，或是否芽生長代謝過程中排出的二氧化碳過多，培養瓶內氧氣不足，造成二氧化碳中毒，引起葉片黃化，有待進一步的研究。

參考文獻：

[1]張建華，毛平生，彭火輝.茶樹的組培快繁技術初探[J].蠶桑茶葉通訊，2003（4）：32～33.

[2]許鴻川.植物學（南方本）[M].北京：中國林業出版社，2010：166.

[3]李勝，李唯.植物組織培養原理與技術[M].北京：化學工業出版社，2007：36～37，10.

[4]張洪昌，李星林.植物生長調節劑使用手冊[M].北京：中國農業出版社，2011：118～119.