核酸適配體篩選技術研究進展

許濤，彭智輝，王澤峰，周佳琪，鄧樂

湖南師范大學 生命科學學院，省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，湖南 長沙 410081

核酸適配體也叫適體、適配子，是利用指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從特定的寡核苷酸庫中篩選出的對靶標有特異性相互作用的單鏈DNA（ssDNA）或RNA，具有高特異性、高親和力、合成成本低、易快速制備、運輸和儲存成本低等優勢[1-2]，近30年來已廣泛應用于生物研究的各個領域。適配體可引入熒光基團[3]、連接納米材料[4]等用于檢測各種靶標。如本實驗室通過將適配體與納米材料如量子點、碳納米管、氧化石墨烯等修飾構建生物傳感器，應用于ATP[5]、流感病毒[6]、K88 大腸桿菌[7]、沙門菌[8-9]等的檢測，有效降低了檢測時間和成本。

然而，適配體在應用方面相比于抗體還遠遠不夠，影響適配體發展的瓶頸主要是適配體的篩選機理還未完全清楚，且當前適配體的應用文獻快速增長而篩選相關的文獻開始滯停。筆者對2013以來（截至2017-10-08）的適配體相關文獻進行了檢索統計（表1），有關適配體的文獻有6634篇，而其中與篩選有關的只有1063篇，2014、2015年到達高峰期，之后開始下降。核酸適配體篩選過程主要包括確立篩選方法、建立篩選文庫、實施具體篩選策略、表征其親和力。對其篩選過程進行優化，旨在改良和發展SELEX技術，提高篩選效率與適配體性能。

我們針對當前較為熱門的核酸庫優化、篩選策略改進、次級文庫序列分析和適配體結構優化等篩選過程的近年相關文獻數據進行統計（表1），并對其研究進展做簡要綜述。

1 核酸庫優化

2013年至今近25%（241篇）的適配體篩選文獻與核酸文庫優化相關，由此可見，合理的核酸庫優化方法對適配體篩選至關重要。核酸庫優化應結合整個篩選流程，以增加核酸庫的穩定性，提高對靶標的親和力，避免核酸酶的降解以及提高篩選效率。從其中較為常見的非天然核苷酸替代傳統核苷酸、鏡像核酸庫代替核酸庫等優化方法相關文獻發表量來看，近2年相對于2013、2014年有所下降，推測可能是因為新的篩選方法如微流控、微陣列等的出現，使人們對核酸庫優化的關注度下降。盡管如此，作為篩選的基礎，對核酸庫優化方法進行探討仍很有必要。

1.1 非天然核苷酸替代傳統核苷酸

為提高核酸庫的穩定性，增強其對靶標的親和力，可以對核酸分子進行設計修飾，如氟代、氨基化、硫代磷酸化或甲基化等[10]。Lamberti等[11]在2′位氟化的隨機RNA文庫中，通過磁珠固定法篩選出Kd=4.15 nmol/L的癌抗原125的適配體，可開發作為診斷工具使用。Minagawa等[12]使用baseappended base（BAB）方法，用尿嘧啶代替胸腺嘧啶修飾DNA文庫，經過8輪選擇篩選出α唾液淀粉酶的高特異性適配體AMYm1。實驗分析表明，與天然核酸庫相比，BAB法修飾的核酸庫可以獲得更多不同的構象來適應不同的靶標，對未來適配體發展非常有參考價值。Tolle等[13]研究了一種新穎的通用型堿基修飾方法，通過核酸文庫化學空間的模塊化擴增，在復制擴增后擁有更多的化學修飾位點，適用于篩選各種不同的甚至是目前很難篩選到的適配體。用非天然核苷酸替代傳統核苷酸對核酸庫進行修飾方法頗多，容易實現，是常見的優化方式。

1.2 鏡像核酸庫代替核酸庫

對核酸分子進行設計修飾可提高其穩定性，但不能消除核酸酶對核酸分子的降解。而鏡像適配體序列作為天然DNA或RNA的對映體，具有適配體的特性但對核酸酶不敏感，因而常用于體內小分子（如肽類激素、細胞因子）適配體的篩選。Wang等[14]化學合成了D-氨基酸聚合酶，能識別和催化L-DNA模板轉錄聚合，可用于催化生成新的鏡像核酸庫或鏡像適配體。Szeitner等[15]以肌鈣蛋白Ⅰ中多肽的對映體為靶標，用鏡像核酸庫篩選獲得Kd為3.5和10.7 nmol/L的鏡像適配體。Vater等[16]對篩選出的3種鏡像適配體的研究表明其十分安全，可用于治療各種不同疾病。

表1 Web of Science適配體篩選相關文獻發表量（2013-01-01～2017-10-08）

2 適配體的篩選策略

適配體篩選策略在篩選技術中最為重要，目前傳統的篩選策略已較為成熟，2011年以來，本實驗室先后用多孔板吸附、離心分離、免疫磁珠法等篩選策略篩選出大腸桿菌K88菌毛蛋白[17]、細胞[7]適配體，鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白[18]、細胞[19]適配體等。近幾年，一些新的篩選策略如毛細管電泳篩選、微流控芯片技術、粒子展示、微陣列芯片等技術被用于篩選適配體，而且多種方法開始交叉使用，以達到以更少的輪次篩選出更優適配體的目的，且親和力越來越高。

2.1 毛細管電泳-SELEX技術

毛細管電泳（CE）由于其超高的分離效率廣泛應用于生物分析、食品安全分析以及醫學檢測等領域。2004年首次引入SELEX技術，即CESELEX技術，發現只需要1～4輪篩選（傳統方法則需要8～12輪）就可獲得核酸適配體[20]。但CESELEX技術進樣體積為納摩爾級別，文庫中DNA分子的數量通常少于1013，因此對篩選技術要求更高[21]。

Ruff等[22]結合定量PCR方法對CE-SELEX技術做了改進，3輪即篩選到牛血清蛋白的適配體。Eaton等[23]利用CE-SELEX技術篩選到卵巢癌標志物的核酸適配體，結合高通量測序與生物信息學在線數據庫對適配體進行對比分析，為適配體的大量、快速篩選提供了新思路。羅昭鋒等[24]用毛細管電泳技術分離，分段收集復合物后分別進行熒光定量PCR擴增，建立了一種快速的適配體篩選方法。

結合表1數據可以看出，CE-SELEX技術興起相對較早，在新興篩選策略中的應用仍遠遠大于其他幾種，儀器操作簡單、使用成本較低、高效快速的篩選優勢使其仍舊十分熱門。

2.2 微流控芯片-SELEX技術

微流控芯片是以硅制品（如玻璃）和有機聚合物為材料，用微細加工技術在芯片上構建由微通道、微反應室、儲液池等微功能單元構成的微流路系統[25]。將微流控芯片用于SELEX技術，可使樣品與試劑的消耗降低至納升甚至皮升級，分析速度成十倍上百倍地提高而費用大大降低。

Lou等[26]設計了一個連續微流磁激活分離芯片，用緩沖液連續層流沖洗帶靶標的磁珠，只需1輪便可篩選出特異性核酸適配體，相比于傳統SELEX技術，可降低篩選輪次，獲得更高親和力的適配體。Hung等[27]用微流控芯片-SELEX技術，建立了一種高通量、快速、高效的細胞適配體篩選技術。Olsen等[28]提出了一種簡單的微流控方法，結合磁珠的生化反應和溶液中寡核苷酸的電化學轉移，實現了在一個芯片上完成整個SELEX過程的篩選和富集，并將篩選時間減少至4 h。Hong等[29]利用磁珠圖案化芯片建立了一個多功能的適配體篩選平臺，使得篩選過程變得更為高效和可控。

將微流控芯片技術應用于適配體篩選是較為新穎的篩選方法，它克服了人為操作導致的不利因素，能極大地提高篩選速度。然而，芯片建模成本較高，目前應用仍舊較少。如果能夠找到通用的微流控芯片并進行產業化生產，必定能使微流控芯片技術成為未來的發展趨勢。

2.3 微陣列芯片-SELEX技術

傳統的適配體篩選方法需要對每個適配體的親和力與特異性進行分析，費時費力，因而需要一種多路復合的方法同時對成千上萬的適配體進行檢測。微陣列芯片是將數十到數萬個探針分子以陣列的形式固定于一張厘米見方的基板上，俘獲樣品中的靶分子，通過熒光、化學發光或質譜分析系統讀取每個位點的信息，具有高通、微量和自動化等優點[30]。

微陣列芯片技術在藥物篩選和分離檢測方面應用較多，近幾年才用于適配體篩選。Gotrik等[31]用DNA微陣列芯片同時識別出上千條候選適配體，通過結合微流控技術、HTS鑒定親和力和特異性，分離出高效適配體，從而改變傳統篩選需要的輪次多、鑒定方法耗時等缺點。Liu等[32]將微陣列芯片技術與微流控芯片技術結合起來，通過熒光微陣列掃描觀察候選適配體與靶標之間的相互作用，3輪便篩選到乳鐵蛋白的5個穩定高效適配體。

由于微陣列芯片技術所需設備昂貴、多樣品平行分析能力不夠、分析時間長，而微流控芯片技術高效快速，目前常將微陣列芯片技術與微流控芯片技術聯合使用。

2.4 粒子展示-SELEX技術

粒子展示法多用于同源蛋白質的多重靶分子交替篩選，SELEX過程中須結合微乳液PCR技術及流式細胞儀[33]。粒子展示法中每個適配體的相對親和力是獨立測量和分類的，在篩選中能實現更高水平的濃縮，可追蹤到每一輪單個適配體的結合情況，隨時調整分選策略，大大減少篩選輪數（只需3～4輪），從而減小多輪篩選擴增中不可避免的選擇偏向，因而篩選效率比傳統的SELEX技術更高。

目前已利用此方法篩選到凝血酶[34]、纖溶酶原激活物1[35]、酪氨酸蛋白磷酸化酶[36]及腫瘤壞死因子超家族成員4-1BB[37]的高親和力適配體。Wang等[38]研究出一種多參數粒子展示法，每小時可分選107個核酸，且在濃度低至納摩爾的人血清中篩選出3種不同蛋白的適配體。受流式細胞儀分選能力的局限，如果可在微乳液中進行體外轉錄，則可實現RNA適配體的篩選[39]。

作為一個新興的篩選技術，粒子展示法有獨特的篩選優勢，發展潛力巨大。但實際操作中要使用到微乳液PCR和流式細胞儀分選，流程較為復雜，要求的操作技術高，適用范圍較窄，因此在新興策略中并沒有被大規模應用。

3 次級文庫序列分析

篩選出的候選適配體文庫需要通過克隆測序得到DNA序列。常規的適配體篩選工作重復性高，費時費力，需要在10多輪常規篩選后才能進行測序，得到幾條親和力和特異性較高的適配體。由于篩選輪次過多，最后篩選出的適配體不一定是最優的。隨著分子生物學與計算機技術的迅猛發展，高通量測序應運而生。通過對逐輪篩選出的次級庫進行高通量測序，獲得每輪次級庫的序列信息，再用生物信息學方法分析出次級庫中更有可能成為適配體序列的重復序列[40]。通過高通量測序可以降低篩選輪次，高效快速地篩選出更優適配體，減少人力物力損耗。

Rachel等[41]以卵巢癌生物標記物HE4為靶標，對每輪篩選獲得的次級庫進行高通量測序，發現重復序列的比值上升，證明每輪SELEX過程都有適配體序列的富集。Ditzler[42]用高通量篩選法評估了結合人類免疫缺陷病毒（HIV）反轉錄酶的RNA適配體，進一步驗證了高通量測序技術的高效性。

從近年的文獻數分析，雖然高通量測序技術應用于適配體篩選越來越多，但由于高通量測序的成本較高，在篩選應用中所占比例還很低。隨著第三代測序技術和測序儀的迅猛發展，高通量測序成本將會逐步降低，毫無疑問它在適配體篩選方面的應用將會得到極大普及。

4 適配體結構優化

通過SELEX技術獲得的適配體不一定可直接應用于檢測，因而需要優化來改善和調節它們的功能[43]。對篩選得到的適配體，依據適配體與靶標的作用機理及后期檢測和藥物設計等目的考慮，可將適配體進行適當的結構優化，以提高親和力和特異性、降低合成成本、延長其體內消除時間或抑制其降解。常用的優化方法有截短、化學修飾、鎖核酸替換、突變、3′或 5′加帽等[44-45]。以下著重介紹應用最多的堿基突變與修飾和序列截短。

4.1 堿基突變與修飾

通過對適配體進行堿基突變或修飾，可提高其穩定性并增加其生物學活性，也為適配體與靶標分子結合提供更多的位點[46]。

Zheng等[47]設計了多條突變序列，將核苷酸突變為G-四聯體結構所必需的鳥嘌呤核苷酸，使親和力提高了30倍。張光普[48]等探索了一種引入烷基功能基團方法，設計合成烷基化修飾的核酸適配體，結果表明1位磷硫（PS）烷基化修飾可提高其與靶蛋白作用能力和血清穩定性，并表現出較強的腫瘤細胞生長抑制作用。

盡管出現相對較早，由于其獨特的優勢，堿基突變與修飾仍是目前甚至今后很長一段時間較為熱門的結構優化方法。

4.2 序列截短

固定序列為適配體兩端用于PCR擴增的引物區，約占全長的50%。Ellington等[49]發現，固定序列既不利于也不限制適配體的結合，只是最低限度地參與適配體的整體結構形成。減小分子量可以增加適配體的組織滲透率，因而可以選擇一個家族中同源性較好的部分序列作為研究對象進行適當的剪裁，直至找到最短結合序列。

Huang等[50]截短乳腺癌異質性核糖核蛋白適配體的核心序列，經異核苷聯合2′-脫氧肌苷修飾，其血清穩定性和靶標特異性明顯提高。Zheng等[51]截去海洋聚醚類毒素適配體序列的引物區及非必需核苷酸，獲得了2段與靶標有高親和力的核心序列。Xu等[52]用結構計算建模方法截短前列腺特異膜抗原適配體，截短后的適配體擁有更短的核苷酸長度，所以更容易在體外合成，生產成本更低，其靶向治療潛力更大。

序列截短增加了適配體與靶標的親和力，減少了堿基數，有效提高了適配體的應用價值，因而雖然關于適配體篩選的文獻開始減少，序列截短應用的研究卻有所上升。

5 結語

適配體性質獨特，前景很廣，但如今可用的適配體數量遠不能滿足科研需求，其篩選方法仍須完善，其與靶標的作用機理亟待闡明。本文從其篩選過程出發，總結了較為新穎熱門的適配體篩選方法，以便于相關研究者更快地了解適配體發展動向。

從目前適配體在診斷和治療方面的應用效果來看，制約適配體進一步應用的影響因素主要有：①適配體親和力不高或重現性不好；②適配體篩選周期長，與靶標親和結合的機理研究不深入；③適配體篩選過程監控手段不多，特別是低成本高效簡便的方法不多。這些因素都和適配體篩選技術有關，盡管近年來新的篩選策略開始出現，但更多的目光還是放在適配體的應用而不是篩選方向上，這也直接導致了2015年以來關于適配體篩選方法的文獻數量減少，關于篩選方法的研究開始降溫，其篩選技術的發展任重道遠。

隨著適配體研究的深入，微陣列、微流控芯片、納米技術、高通量測序等高科技手段與之結合，適配體的應用將更加廣泛。從目前的研究情況來看，我們認為今后應從以下方面完善適配體篩選技術：①將高通量測序和一些先進的篩選策略相結合，以最少的篩選輪數和最小的擴增偏差篩選得到高特異性高親和力的適配體，在應用時提高重現性；②探究適配體與靶標之間相互作用的具體機制，找到更高效的適配體篩選方法；③發展適配體篩選過程監控技術，結合單分子測序等新一代測序方法，建立更加精準、自動化的篩選平臺，降低篩選輪次；④將適配體與抗體類比，利用其獨特的可變復性、可堿基配對、可復制等性質，應用于影像、檢測、診斷、傳感器、藥物靶向運輸、親和捕獲純化等方面。相信從以上幾個方面優化適配體篩選過程，篩選出更多可用適配體，極有可能超過抗體，廣泛應用于生物分析、食品安全、臨床醫學診斷治療及其他領域。

[1] Ellington A D,Szostak J W.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature,1990，346:818-822.

[2] Gold L,Tuerk C.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Science,1990,249:505-510.

[3] Peng Z H,Ling M,Ning Y,et al.Rapid fluorescent detection of Escherichia coli K88 based on DNA ap?tamer library as direct and specific reporter combined with immuno-magnetic separation[J].JFluorescence,2014,24(4):1159-1168.

[4] Yang M,Peng Z H,Ning Y,et al.Highly specific and cost-efficient detection of Salmonella paratyphi A combining aptamers with single-walled carbon nano?tubes[J].Sensors,2013,13(5):6865-6881.

[5] Li Z J,Song Y,Zhu W H,et al.A terminal protec?tion system forthe detection ofadenosine triphos?phate via enzyme-assisted signal amplification[J].Anal Methods,2015,7:970-975.

[6] Feng X R,Liu K Y,Ning Y,et al.A label-free apta?sensor for rapid detection of H1N1 virus based on gra?phene oxide and polymerase-aided signal amplification[J].J Nanomed Nanotechnol,2015,6(3):1000288.

[7] Ling M,Peng Z H,Cheng L J,et al.Rapid fluores?cent detection of enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)K88 based on graphene oxide-dependent nano?quencher and Klenow fragment-triggered target cyclic amplification[J].Appl Spectroscopy,2015,69(10):1175-1181.

[8] Liu K Y,Yan X,Mao B Y,et al.Aptamer-based de?tection of Salmonella enteritidis using double signal amplification by Klenow fragmentand dualfluores?cence[J].Microchimica Acta,2016,183(2):643-649.

[9] Yan X,Li W K,Liu K Y,et al.Highly sensitive flu?orescent aptasensor for Salmonella paratyphi A via DN?ase I-mediated cyclic signalamplification[J].Anal Methods,2015,7(24):10243-10245.

[10]Zhang L.Unnatural nucleic acids for aptamer selection[M]//Aptamers selected by cell-SELEX for theranos?tics.Springer Berlin Heidelberg,2015:35-65.

[11]Lamberti I,Scarano S,Esposito C L,et al.In vitro se?lection of RNA aptamers against CA125 tumor marker in ovarian cancer and its study by optical biosensing[J].Methods,2016,97:58-68.

[12]Minagawa H,Onodera K,Fujita H,et al.Selection,characterization and application of artificial DNA ap?tamer containing appended bases with sub-nanomolar affinity for a salivary biomarker[J].Sci Rep,2017,7:42716.

[13]Tolle F,Br?ndle G M,Matzner D,et al.A versatile approach towards nucleobase-modified aptamers[J].An?gewandte Chemie,2015,54(37):10971-10974.

[14]Wang Z,Xu W,Liu L,et al.A synthetic molecular system capable ofmirror-image genetic replication and transcription[J].Nat Chem,2016,8:698-704.

[15]Szeitner Z,Lautner G,Nagy S K,et al.A rational ap?proach for generating cardiac troponin I selective Spie?gelmers[J].Chem Commun,2014,50(51):6801-6804.

[16]Vater A,Klussmann S.Turning mirror-image oligonu?cleotides into drugs:the evolution of Spiegelmer thera?peutics[J].Drug Discovery Today,2015,20(1):147-155.

[17]Li H,Ding X H,Peng Z H,et al.Aptamer selection for the detection of Escherichia coli K88[J].Can J Mi?crobiol,2011,57(6):453-459.

[18]Ning Y,Li Z J,Duan Y F,et al.A novel biosensor fordetection ofS typhimurium carrying SSeC gene based on the secondary qurnching effectofcarbon nanotubes[J].J Nanomater Mol Nanotech,2013,2:5-9.

[19]Duan Y F,Ning Y,Song Y,et al.Fluorescent aptas?ensor for the determination of Salmonella typhimurium based on a graphene oxide platform[J].Microchim Ac?ta,2014,181(5):647-653.

[20]Mendonsa S D,Bowser M T.In vitro selection of high-affinity DNA ligands for human IgE using capil?lary electrophoresis[J].Anal Chem,2004,76(18):5387-5392.

[21]Hagiwara K,Fujita H,Kasahara Y,et al.In vitro se?lection of DNA-based aptamers that exhibit RNA-like conformations using a chimeric oligonucleotide library that contains two different xeno-nucleic acids[J].Mol Bio Systems,2015,11(1):71-76.

[22]Ruff P,Pai R B,Storici F.Real-time PCR-coupled CE-SELEX for DNA aptamer selection[J].Isrn Mol Bi?ol,2012,2012(4968).

[23]Eation R M,Shallcross J A,Mael L E,et al.Selec?tion of DNA aptamers for ovarian cancer biomarker HE4 using CE-SELEX and high-throughput sequenc?ing[J].Anal Bioanal Chem,2015,407(23):6965-6973.

[24]羅昭鋒,周宏敏,王潔,等.一種基于分段收集的親和核酸分子的篩選方法[P].中國:CN103525820A,2014-01-22.

[25]許斌,李佩.微流控芯片及其應用[J].記錄媒體技術,2009,7(3):29-32.

[26]Lou X,Qian J,Xiao Y,et al.Micromagnetic selection ofaptamers in microfluidic channels[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:2989-2994.

[27]Hung L Y,Wang C H,Hsu K F,et al.An on-chip Cell-SELEX process for automatic selection of high-af?finity aptamers specific to different his tologically clas?sified ovarian cancer cells[J].Lab Chip,2014,14(20):4017-4028.

[28]Olsen T R,Tapiaalveal C,Yang K A,et al.Integrat?ed microfluidic selex using free solution electrokinetics[J].J Electrochem Soc,2017,164(5):B3122-B3129.

[29]Hong S L,Wan Y T,Tang M,et al.Multifunctional screening platform for the highly efficient discovery of aptamers with high affinity and specificity[J].Anal Chem,2017,89(12):6535.

[30]滿燕,呂雪飛,彭廣,等.雙適配體夾心微陣列芯片在凝血酶檢測中的應用[J].生命科學儀器,2014,12(Z1):69-71.

[31]Gotrik M R,Feagin T A,Csordas A T,et al.Ad?vancements in aptamer discovery technologies[J].Ac?counts Chem Res,2016,49(9):1903-1910.

[32]Liu X,Li H,Jia W,et al.Selection of aptamers based on a protein microarray integrated with a micro?fluidic chip[J].Lab Chip,2016,17(1):178-185.

[33]Wang J,Gong Q,Maheshwari N,et al.Particle dis?play:a quantitativescreening method forgenerating high-affinity aptamers[J].Angew Chem Int Ed,2014,53(19):4796-4801.

[34]Zhu Z,Song Y,Li C,et al.Monoclonal surface dis?play SELEX for simple,rapid,efficient and cost-effec?tive aptamer enrichmentand identification[J].Anal Chem,2014,86(12):5881-5888.

[35]Fortenberry Y M,Brandal S M,Carpentier G,et al.Intracellular expression of PAI-1 specific aptamers al?ters breast cancer cell migration,invasion and angio?genesis[J].PLoS One,2016,11(10):e0164288.

[36]Zhang W Y,Zhang W,Liu Z,et al.A highly paral?lelsinglemoleculeamplification approach based on agarose droplet PCR for efficient and cost-effective ap?tamer selection[J].Anal Chem,2011,84(1):350-355.

[37]Schrand B,Berezhnoy A,Brenneman R,et al.Reduc?ing toxicity of 4-1BB costimulation:targeting 4-1BB li?gands to the tumor stroma with bi-specific aptamer conjugates[J].Oncoimmunology,2015,4(3):e970918.

[38]Wang J P,Yu J W,Yang Q,et al.Multiparameter particle display(MPPD):a quantitative screening meth?od for the discovery of highly specific aptamers[J].An?gew Chem Int Ed Engl,2017,56(3):744-747.

[39]Stubbs S H,Conrad N K.Analysis of RNA-protein in?teractions by cell mixing[J].Meth Enzymol,2014,539:67-80.

[40]Sharma T K,Bruno J G,Dhiman A.ABCs of DNA aptamer and related assay development[J].Biotechnol Adv,2017,35(2):275-301.

[41]Eaton R M,Shallcross J A,Mael L E,et al.Selec?tion of DNA aptamers for ovarian cancer biomarker HE4 using CE-SELEX and high-throughput sequenc?ing[J].Anal Bioanal Chem,2015,407(23):6965-6973.

[42]Ditzler M A,Lange M J,Bose D,et al.High-through?put sequence analysis reveals structural diversity and improved potency among RNA inhibitors of HIV re?verse transcriptase[J].Nucleic Acids Res,2013,41(3):1873-1884.

[43]Wang R E,Wu H,Niu Y,et al.Improving the stabili?ty of aptamers by chemical modification[J].Curr Med Chem,2011,18(27):4126-4138.

[44]Darmostuk M,Rimpelova S,Gbelcova H,et al.Cur?rent approaches in SELEX:an update to aptamer se?lection technology[J].Biotechnol Adv,2015,33(6):1141-1161.

[45]Meek K N,Rangel A E,Heemstra J M.Enhancing aptamer function and stability via in vitro selection us?ing modified nucleic acids[J].Methods,2016,106:29-36.

[46]Kimoto M,Yamashige R,Matsunaga K,et al.Genera?tion of high-affinity DNA aptamers using an expand?ed genetic alphabet[J].Nat Biotech,2013,31:453-457.

[47]Zheng X,Hu B,Gao S X,et al.A saxitoxin-binding aptamer with higher affinity and inhibitory activity op?timized by rational site-directed mutagenesis and trun?cation.[J].Toxicon,2015,101:41-47.

[48]Zhang Guangpu,Deng Jiali,Yang Xiantao,et al.Selec?tive alkylation and bioactivity of phosphorothioated nu?cleolin aptamer AS1411[J].J Chin Pharm Sci,2017,26(1):23-30.

[49]Yang Y,Ren X,Schluesener H,et al.Aptamers:se?lection,modification and application to nervous system diseases[J].Curr Med Chem,2011,18(27):4159-4168.

[50]Huang Y,Tian M,Zhang Y,et al.D-Isonucleotide(isoNA)incorporation around cleavage site of passen?ger strand promotes the vibration of Ago2-PAZ do?main and enhances in vitro potency of siRNA[J].Org Biomol Chem,2015,13(44):10825-10833.

[51]Zheng X,Hu B,Gao S X,et al.A saxitoxin-binding aptamer with higher affinity and inhibitory activity op?timized by rational site-directed mutagenesis and trun?cation[J].Toxicon,2015,101(7):41-47.

[52]Xu X,Dickey D D,Chen S J,et al.Structural compu?tational modeling of RNA aptamers[J].Methods,2016,103:175-179.