高敏化學發光法測定丙肝病毒抗體的臨床性能評價

石玉玲，謝思，許蔓春，廖揚，張衛云，陳建蕓

廣州軍區廣州總醫院 檢驗科，廣東 廣州 510010

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是嚴重威脅人類健康的病原體之一，已成為全球性的公共衛生問題[1]。據WHO報告，全球約1.7億人感染HCV，感染率約為3%，每年新增感染者約300～400萬，死亡25萬例[2]。我國HCV平均感染率約為3.2%[3]，感染者約3800萬人，且近年來發病率呈上升趨勢[4]。研究發現80%的HCV患者因早期診斷和治療不及時發展成為慢性肝炎，約10%最終發展為肝硬化甚至肝癌[5]。作為傳染性疾病，實驗室診斷水平對丙肝的診斷和預防具有重要意義，早期診斷并及時治療是防止病毒傳播的有效手段。自從1989年建立了抗-HCV檢測方法以來，丙型肝炎的檢測技術就處于不斷發展中。目前，抗-HCV IgG實驗室檢測方法主要有膠體金法、酶聯免疫吸附法（ELISA）、化學發光法、重組免疫印跡法（RIBA），而不同的方法學檢測HCV的特異性和靈敏度往往存在較大差異。并且，由于HCV核酸和蛋白變異很大，試劑的抗原包被并未包含所有HCV的基因區，因而有造成漏檢的可能[6]。因此，如何選擇靈敏、準確、及時的檢測方法，對于HCV的診療具有重要的臨床意義。我們對Sysmex HISCL-5000化學發光酶免疫儀的檢測性能進行了分析評價，并對不同的檢測HCV方法做對比分析，找出提高丙肝診斷率尤其是早期診斷率的更好的實驗室檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

采集廣州軍區廣州總醫院2014年11月～2015年2月住院、門診HCV患者清晨空腹血液標本826例，HCV診斷符合2004年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、中華醫學會肝病學分會聯合修訂的《丙型肝炎防治指南》的有關標準[7]。標本經3000 r/min離心5 min分離血清后立即檢測。

Sysmex HISCL-5000高敏發光全自動免疫分析儀及配套試劑；HCV質控品；HCV校準品（批號05424818）；雅培ARCHITECT i2000微粒子化學發光全自動免疫分析儀及配套試劑；Mikrogen公司的RIBA試劑盒；BBI Diagnostics的HCV血清轉化盤；ADC600 ELISA全自動酶免疫分析儀及配套試劑。

1.2 精密度試驗

精密度是在規定條件下重復檢測樣本的結果一致程度，是檢測系統基本分析性能的指標之一[8-10]。通過批內和批間變異進行精密度評價[11]，參考CLSI的EP15-A2文件[12]。批內精密度試驗，選取高、低3個濃度水平，充分混勻，對每個水平重復測定20次。批間精密度試驗，選取高、低2個濃度水平，充分混勻重復10 d，每天每個水平重復測定2次，共20次。

1.3 一致率試驗

選取臨床血清標本826例，分別用HISCL-5000和雅培i2000SR檢測HCV，計算陰、陽性一致率及總一致率。同時與科華ELISA檢測弱陽性及弱陰性標本對比。對于不一致的結果進行確認，先對樣本進行復查：復查后如仍不一致，須經RIBA試驗確認。

HCV RIBA試驗步驟：①將反應條放置在試劑盒的反應盤10個槽內，每個長形反應槽內均有一條正面朝上的反應條，在每個反應槽內加入2 mL待用緩沖液，反應條完全浸沒后加入20 μL質控或8個不一致標本，置于振蕩器上孵育搖晃3 h；②快速準確地倒掉液體，接著用緩沖液每隔3 min清洗1次，共清洗5次；③每個槽內加入2 mL第二抗體，置于振蕩器上孵育搖晃45 min；④傾倒液體后進行清洗，步驟同②；⑤加入酶結合物TMB 1.5 mL孵育8 min；⑥用去離子水細流沖洗至少3次，室溫放置10 min，顯色判斷結果。

1.4 臨床特異性與臨床靈敏度

1.4.1 特異性 選取713例陰性樣本、101例干擾樣本，分別用HISCL-5000和ARCHITECT i2000檢測，判斷臨床特異性。

1.4.2 靈敏度 選取陽性標本111例，分別用HISCL-5000和ARCHITECT i2000檢測，判斷臨床靈敏度。

1.5 干擾試驗

測定HCV時，用檢測RF、CMV、EB、TP、ANA、溶血、脂血等病原體感染者或正常人樣本檢測時不應出現陽性。本次實驗單獨選取相關疾病陽性樣本，包括ANA 17例、EB 17例、RF 5例、CMV 31例、TP 16例、脂血5例、溶血5例、妊娠5例，總計101例。

1.6 血清轉化盤

用2種儀器進行HCV由陽到陰血清轉化比對試驗，以判斷結果的窗口期。血清盤分別取自志愿者病人的疾病不同時期的4管血清。

1.7 統計學處理

采用IBMSPSS 19.0和Excel統計軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 HISCL-5000分析儀精密度驗證

批內精密度實驗見表1，批間精密度實驗見表2。

2.2 一致率試驗結果

選取標本826例，分別在HISCL-5000和雅培i2000上測試，分析一致率，結果如表3，陰性一致率為99.0%，陽性一致率為92.5%，總一致率為99.0%。陽性比對中，有5例樣本HISCL檢測為陰性，將不一致標本用RIBA試劑進行確認，結果為2例不確，3例陰性；陰性對比中，有3例樣本HIS?CL檢測為陽性，將不一致標本用RIBA試劑進行確認，結果為2例陰性，1例陽性。確認實驗4例支持HISCL-5000結果，2例支持i2000結果。

表1 HISCL-5000批內重復性及精密度

表2 HISCL-5000批間重復性及精密度

表3 HISCL-5000與i2000 HCV的一致率

選取弱陽性及弱陰性標本共172例，分別用HISCL和科華ELISA測試，分析一致率，結果如表4，陰性一致率為97.3%，陽性一致率為93.9%，總一致率為95.3%。8例樣本檢測不一致，其中2例HISCL檢測為陰性，ELISA檢測為陽性，將不一致標本用雅培i2000和RIBA進行確認，確認結果為陰性；有6例樣本HISCL檢測為陽性，ELISA檢測為陰性，將不一致標本用雅培i2000和RIPA3.0進行確認，確認結果為5例陽性，1例陰性。確認實驗7例支持HISCL5000結果，1例支持科華ELISA結果。

2.3 臨床特異性與臨床靈敏度評估

2.3.1 特異性 選取713例陰性樣本（包含干擾樣本101例）用HISCL-5000檢測，判斷各種方法的臨床特異性。HISCL-5000檢測出711例陰性，臨床特異性達99.7%；雅培i2000檢測出710例陰性，臨床特異性為99.6%；ELISA檢測出690例陰性，臨床特異性為96.8%。

2.3.2 靈敏度 選取陽性標本111例用HISCL-5000檢測，判斷各種方法的臨床靈敏度。HISCL-5000檢測出111例陽性，臨床靈敏度達100.00%；i2000檢測出110例陽性，臨床靈敏度達99.1%；ELISA檢測出105例陽性，臨床靈敏度達94.6%。

2.4 血清轉化盤檢測

血清轉化盤購自ZeptoMetrix公司（Hepatitis C Seroconversion Panel，PHV913），檢測結果見表5。HISCL-5000（＞1.0為反應陽性)與雅培i2000（＞1.0為反應陽性）兩者都能很好地檢測出HCV由陽到陰的轉化，準確度得到驗證，同時也表明2種儀器均具有良好的靈敏度。血清轉化盤試驗能及時發現此疾病的治療變化，其他相關肝臟疾病同理也可根據此結果輔助治療。

表4 HISCL-5000與ELISA法HCV一致率結果

表5 6542血清轉化盤檢測結果

2.5 結果分布圖

根據826例樣本檢測結果繪制分布圖（圖1～3）。HISCL-5000測量結果中，92.2%陰性樣本的C.O.I＜0.1，92.2%陽性樣本的 C.O.I＞3.0；雅培 i2000測量結果中，77.0%陰性樣本的 C.O.I＜0.1，88.1%陽性樣本的 C.O.I＞3.0。

3 討論

丙型肝炎病毒是丙型病毒性肝炎的病原體，丙肝是以肝臟損害為主的一組全身性傳染病，急、慢性丙肝患者及無癥狀攜帶者是丙肝主要傳染源，輸血、針刺、吸毒是丙肝主要的傳播途徑。其急性感染期癥狀不明顯，自然轉陰率非常低，病程容易遷移，臨床療效差，效果不理想，目前還沒有較好的疫苗及藥物治療此疾病。感染過程中常存在不同程度的肝功能損害并呈進行性加重，長期延誤診斷和治療易轉變為肝硬化甚至發展為肝癌[13]。10.0%～20.0%的HCV感染者在感染20年后發展為肝硬化，1.0%～3.0%在感染30年后發展為肝癌[14]。我國屬于丙肝高發區域[15]，加強對丙肝患者的早期診斷和篩查，提高HCV患者早期診斷率是臨床治療和控制疾病傳染的關鍵。

HCV抗體檢測是目前應用最廣泛的流行病學調查和臨床HCV篩查方法，可為HCV的早期發現和治療提供可靠依據[16]。目前抗-HCV的檢測方法主要有ELISA與化學發光法。ELISA是最常用的方法，第3代ELISA檢測試劑增加了NS5區蛋白抗原，聯合HCV核心抗原、NS3和NS4抗原，使抗體的覆蓋率明顯提高，檢測敏感性和特異性也得到提高[17]。但ELISA法需要復雜操作步驟和批量檢測，費時費力。現階段，臨床上多使用美國雅培ARCHITECT化學發光儀檢測HCV抗體。本研究中，我們采用日本Sysmex HISCL-5000測定血液樣本中的HCV抗體。Sysmex HISCL-5000采用高敏發光底物的化學發光酶免疫法，具有反應時間短（17 min）、樣本量少（10～30 μL）、脫磁清洗、干擾物影響少等優點。通過兩步法形成鏈霉素親和素包被的磁珠-生物素化的單克隆抗體-待測血清標本-堿性磷酸酶標記單克隆抗體的復合體，最后加入發光底物CDP-Star，根據其發光強度計算濃度。生物素-親和素相互作用具有高特異性、高敏感性；雙抗體夾心法中用酶標記抗體催化發光底物可使免疫反應的結果得以放大，提高靈敏度；CDP-Star是通過二氧戊烷在堿性磷酸酶的激活作用下以持續的速度發出光信號來進行檢測，靈敏度高，發光時間從幾分鐘開始可以延續數天，所以可多次曝光時間并對曝光時間進行優化，是目前最快速、最靈敏的化學發光底物，曝光時間只需15～60 s。通過反復沖洗進行B/F分離（脫磁清洗），能獲得高于以往儀器的沖洗效果，減少非特異物質和還原背景。

圖1 HISCL-5000檢測結果頻數圖

圖2 i2000檢測結果頻數圖

圖3 ELISA檢測結果頻數圖

精密度檢測表明Sysmex HISCL-5000的重復性較好，測定結果穩定。血清HCV抗體出現較晚，抗體轉陽一般有一個約70 d的較長窗口期，部分患者甚至可長達5～8個月[18]，部分患者在感染治愈或康復后仍可持續陽性，HISCL可檢測出HCV由陽到陰血清轉化，且HISCL使用轉化血清盤檢測比雅培ARCHITECT提前1周測定出由陰轉陽的血清轉化，檢測窗口期提前1周，縮短了HCV感染診斷的窗口期，使抗病毒治療檢測成為可能，表明該檢測方法具有高的準確度。HISCL與雅培i2000的總一致率為99.0%，對不一致結果用RIBA進行確認，結果表明HISCL-5000具有較好的準確度。與科華ELISA試劑的總一致率為95.3%，HISCL-5000的陽性檢測率高于ELISA。這可能與HISCL-5000檢測大大縮短了HCV感染診斷的窗口期有關。綜上所述，HISCL-5000適于丙肝臨床篩查，檢測效果好，值得進一步推廣。

[1] 陳攸濤,江家驥.丙型肝炎病毒流行現狀[J].海峽預防醫學雜志,2009,15(5):19-21.

[2] 李杰,莊輝.病毒性肝炎流行病學進展[J].肝臟,2012,17(1):2-5.

[3]竇曉光,丁洋.慢性丙型肝炎抗病毒治療的新策略和新方法[J].中國實用內科雜志,2010,30(3):217-219.

[4] 劉學芝.東興區2003-2011年丙型病毒性肝炎流行特征及趨勢分析[J].中外健康文摘,2013,(5):69-71.

[5] Kesli R,Polat H,Terzi Y,et al.Comparison of a newly developed automated and quantitative hepatitis C virus(HCV)core antigen test with the HCV RNA assay for clinical usefulness in confirming anti-HCV results[J].J Clin Microbiol,2011,49(12):4089-4093.

[6] Valcavi P,Medici M C,Casula F,et al.Evaluation of a total hepatitis C virus(HCV)core antigen assay for the detection of antigenaemia in anti-HCV posi?tive individuals[J].J Med Virol,2004,73(3):397-403.

[7]中華醫學會肝病學分會,中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分學.丙型肝炎防治指南[Z].2004.

[8] 劉歐,徐國賓,王蘭珍,等.6個檢測系統4種分析方法測定人血清葡萄糖的精密度和正確度調查[J].臨床檢驗雜志,2010,28(3):227-229.

[9] 歐陽能良,王偉佳,李飛,等.應用CLSI EP-A2文件評價BNP和NT-proBNP測定的精密度性能[J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(5):538-540.

[10]溫冬梅,張秀明,吳劍楊,等.應用CLSI EP5-A2文件評價生化檢測系統的精密度性能[J].檢驗醫學與臨床,2010,7(19):2096-2098.

[11]Wang H,Guo P,Sun H,et al.Molecular epidemiolo?gy of clinical isolates of carbapenem-resistant Acineto?bacter spp. from Chinese hospitals[J]. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(11):4022-4028.

[12]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of preci-sion performance of quantitative measurement methods[S].EP15-A2,CLSI,2004.

[13]Temesgen Z,Talwani R,Rizza S A.Sofosbuvir for the treatment of chronic hepatitis C virus infection[J].Drugs Today(Barc),2014,50(6):421-434.

[14]匡國杰,武洪文,肖漓.單中心兩種方法檢測280例群體反應性抗體的對比分析[J].中國組織工程研究,2014,5(12):767-772.

[15]舒玲,李露瑤,馬瑩.丙肝病毒抗體檢測結果的分析與解讀[J].現代預防醫學,2014,2(6):300-303.

[16]張言超,陳明,李強,等.HCV RNA和抗-HCV聯合檢測的診斷意義[J].徐州醫學院學報,2010,30(8):536-537.

[17]Wang T Y,Kuo H T,Chen L C,et al.Use of poly?merase chain reaction for early detection and manage?ment of hepatitis C virus infection after needle stick injury[J].Ann Clin Lab Sci,2002,32(2):137-141.

[18]Swellam M,Mahmoud M S,Ali A A.Diagnosis of hepatitis C virus infection by enzyme-linked immuno?sorbent assay and reverse transcriptase-nested poly?merase chain reaction:a comparative evaluation[J].IUBMB Life,2011,63(6):430-434.