重組人促血小板生成素模擬肽-Fc融合蛋白抗體中和活性檢測方法的建立

崔穎，李曉然，劉福星，朱振宇

北京泰德制藥股份有限公司 研發(fā)中心，北京 100176

注射用重組人促血小板生成素模擬肽-Fc融合蛋白（recombinant human thrombopoietin mimet?ic peptide-Fc fusion protein，TMP-Fc）是羅米司亭（romiplostim）的生物類似藥，主要用于治療慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocyto?penic purpura，ITP）。

目前ITP的治療包括以免疫抑制藥物和脾切除為主的傳統(tǒng)治療方式和以增加血小板生成為機理的促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）受體激動劑治療法。第一代TPO受體激動劑以TPO重組蛋白或其同源序列蛋白為主，會引發(fā)機體產生內源性TPO的中和抗體，使內源性TPO水平降低，導致血小板水平低于用藥前，因此在歐美等國未被批準上市[1-2]。

TMP-Fc和羅米司亭屬于第二代TPO受體激動劑，在人抗體IgG1的Fc片段C端連接2段TPO模擬肽。其中抗體Fc段可與新生Fc受體（FcRn）結合，避免進入溶酶體中被降解，延長藥物在體內的半衰期，降低用藥頻率；TPO模擬肽段發(fā)揮作用的原理與TPO一致，通過與巨核細胞表面的TPO受體Mpl（由myeloproliferative leukemia virus即骨髓增殖白血病病毒基因表達）結合，進而激活JAK-STAT等信號通路，促進巨核細胞發(fā)育并產生血小板，從而達到升高血小板的作用[3]。

TMP-Fc作為重組蛋白注入機體，通常會引發(fā)機體產生針對藥物本身甚至針對內源性蛋白的抗體[4]。由于TPO模擬肽是采用噬菌體展示技術篩選出的與TPO作用一致、無序列同源性的短肽，因此藥物在體內不會產生針對內源性TPO的中和抗體，藥物安全性較高。但是機體仍然會產生針對藥物本身的抗體，如果該抗體只是與藥物結合并不影響藥物的生物學活性，稱之為結合抗體；如果該抗體與藥物發(fā)揮作用的活性區(qū)域或活性區(qū)域附近位點結合，影響藥物的體內生物學活性，稱之為中和抗體。中和抗體的產生會影響藥物的有效性，因此在生物制品開發(fā)過程中對中和抗體的監(jiān)測十分重要。為評價TMP-Fc在免疫原性研究中產生抗體的性質，我們開發(fā)了基于MO7e細胞增殖法的TMP-Fc抗體中和活性檢測方法，并應用于免疫原性研究中樣品的分析。

1 材料和方法

1.1 材料

人巨核細胞白血病細胞株MO7e由天津協(xié)和血液研究所提供；羅米司亭由協(xié)和麒麟株式會社提供；TMP-Fc活性對照品（批號20131220）由北京泰德制藥股份有限公司（以下簡稱本公司）制備；抗TMP-Fc陽性血清及小鼠抗TMP-Fc單克隆抗體由京天成生物技術（北京）有限公司制備；注射用TMP-Fc重復皮下注射給予食蟹猴的免疫原性血清由北京昭衍新藥研究中心股份有限公司提供；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、臺盼藍購自Gibco公司；CCK-8購自同仁化學公司；酶標儀和Gene5分析軟件為BioTek公司產品。

1.2 MO7e細胞的培養(yǎng)

MO7e細胞為半貼壁細胞，依賴生長因子增殖，可用于測定多種細胞因子的活性[5]。該細胞培養(yǎng)時若不加入細胞因子，生長異常緩慢甚至死亡，因此常規(guī)培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基＋10%FBS+粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）。傳代按活細胞濃度 5×104～10×104/mL的密度接種，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，待細胞長至對數(shù)生長期可用于檢測。

1.3 TMP-Fc促進MO7e細胞增殖的方法確立

根據(jù)本公司自主開發(fā)的TMP-Fc生物學活性檢測方法，TMP-Fc活性對照品起始濃度為50 μg/mL，1/5梯度稀釋至0.0256 ng/mL，共9個梯度濃度，按50 μL/孔加入96孔板中；取對數(shù)生長期的MO7e細胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗2～3次，將常規(guī)培養(yǎng)中的GM-CSF去除，調整細胞密度至 2×105/mL，按 150 μL/孔接種于 96 孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60～72 h；加入CCK-8溶液 10 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，于酶標儀上測定D450nm和D600nm值，利用Gene5軟件制作四參數(shù)回歸曲線，確定TMP-Fc促進MO7e細胞增殖的范圍。

1.4 抗TMP-Fc陽性血清對MO7e細胞增殖的影響

以TMP-Fc促進Mo7e細胞增殖法為基礎，選擇處于對數(shù)增長期的3個TMP-Fc濃度（80、16和3.2 ng/mL），分別與梯度稀釋的陽性血清（過濾除菌）等體積混勻，50 μL/孔加入96孔板中。按照1.3的方法處理細胞，接種培養(yǎng)并顯色分析。

1.5 空白血清對MO7e細胞增殖的影響

將混合空白猴血清（PMS）進行梯度稀釋（1/5、1/10、1/20、1/40）制備成不同濃度的樣本；將一定濃度的TMP-Fc作為藥物對照，按50 μL/孔加入96孔板中；按照1.3的方法處理細胞，接種培養(yǎng)并顯色，于酶標儀上測定D450nm和D600nm值，根據(jù)樣本吸光度值計算樣本抑制率，以確定不影響檢測的樣本最小稀釋率。

1.6 TMP-Fc抗體中和活性檢測方法的藥物濃度篩選

將1/10稀釋的PMS與一定濃度的TMP-Fc溶液等體積混合，作為單抗稀釋液，將抗TMP-Fc單克隆抗 體系 列稀釋 至 20、60、180、540、1620、3200 ng/mL，按 50 μL/孔加入 96孔板，按照 1.3的方法處理細胞，接種培養(yǎng)并顯色分析。

1.7 TMP-Fc抗體中和活性檢測方法實驗閾值確定

將25個空白食蟹猴血清分別用MO7e細胞培養(yǎng)液稀釋至1/10，過濾后與32 ng/mL的TMP-Fc等體積混合，作為實驗閾值（cut point，CP）樣本，此樣本的TMP-Fc濃度為16 ng/mL，血清稀釋率為 1/20；將稀釋至 1/10的 PMS與 32 ng/mL的TMP-Fc溶液等體積混合，作為陰性對照。采用MO7e細胞增殖法檢測CP樣本對細胞增殖的抑制率。獨立重復3次，每個樣本設置復孔，根據(jù)樣本及陰性對照吸光度（D）值計算抑制率。

計算每一次獨立實驗CP樣本的抑制率均值和標準差；在99.9%的置信水平下，單次實驗閾值=均值+3.09×標準差；3批次實驗閾值的平均值即為篩選實驗閾值[6]。

1.8 食蟹猴免疫原性血清樣本的檢測

根據(jù)TMP-Fc重復皮下注射給予食蟹猴4周和恢復期4周的免疫原性的結合抗體檢測結果，將結合抗體檢測為陽性的血清進行中和抗體檢測。將待檢血清稀釋至1/10，與32 ng/mL的TMP-Fc等體積混合，作為待檢樣本，按50 μL/孔加入96孔板中，按照1.3的方法處理細胞，接種培養(yǎng)并顯色，于酶標儀上測定D450nm和D600nm值，根據(jù)樣本吸光度值計算樣本抑制率，根據(jù)實驗閾值判定樣本中和抗體是否為陽性。

2 結果

2.1 TMP-Fc促進MO7e細胞增殖的方法確立

基于TMP-Fc與MO7e細胞表面TPO受體（Mpl）結合進而引起細胞增殖的原理，將梯度稀釋的TMP-Fc與MO7e細胞相互作用，通過比色法測定細胞增殖情況，建立測定TMP-Fc活性的MO7e細胞增殖法。

TMP-Fc對MO7e細胞增殖具有促進作用，細胞增殖曲線如圖1，隨著TMP-Fc濃度的增加，呈典型“S”型增殖曲線。3次實驗細胞增殖曲線重復性較好，說明方法穩(wěn)定可靠，細胞增殖曲線對數(shù)增長期對應的濃度范圍均為3.2～80 ng/mL，為后續(xù)抗體中和活性檢測方法的建立奠定了基礎。

2.2 抗TMP-Fc陽性血清對MO7e細胞增殖的影響

抗體中和活性檢測方法的原理是基于中和抗體能減弱甚至消除藥物的生物學活性。文獻建議選擇一定的藥物濃度，在此濃度下檢測中和抗體對藥物作用的影響[7]。選擇處于對數(shù)增長期3個TMP-Fc濃度（80、16和3.2 ng/mL），分別與梯度稀釋的陽性血清等體積混合，以3.2 ng/mL TMP-Fc作為陰性對照，結果如圖2所示，在陽性血清稀釋率低于1/10 000時，均對MO7e細胞的增殖有明顯的抑制作用。TMP-Fc濃度為3.2 ng/mL時細胞增殖作用不明顯，因此選擇16～80 ng/mL建立抗體中和活性檢測方法。

2.3 空白血清對TMP-Fc促MO7e細胞增殖的影響

抗體中和活性檢測方法為MO7e細胞增殖法，通常動物血清會干擾細胞的生長狀態(tài)，進而影響檢測結果。根據(jù)文獻報道及FDA建議[8]，最小稀釋率一般不超過1/100，否則會影響方法的靈敏度。

表1結果顯示，含PMS濃度5%（1/20稀釋）以上時，會對TMP-Fc促細胞增殖產生明顯的抑制作用（抑制率達31.30%～55.39%），對中和抗體的檢測產生影響；含PMS濃度5%（1/20稀釋）以下時，對TMP-Fc促細胞增殖的抑制作用相對較弱，對中和抗體的檢測影響較小。血清濃度5%（1/20稀釋）與血清濃度2.5%（1/40稀釋）對細胞增殖的抑制率分別為16.59%和12.50%，說明進一步稀釋血清并未明顯降低基質干擾作用，因此選擇血清的最小稀釋率為1/20，在干擾較小的情況下盡量提高方法的靈敏度。

表1 空白血清對TMP-Fc促MO7e細胞增殖的影響

圖1 TMP-Fc促進MO7e細胞增殖反應曲線

圖2 抗TMP-Fc血清對MO7e細胞增殖的抑制作用

2.4 TMP-Fc抗體中和活性檢測方法的藥物濃度篩選

根據(jù)2.2及2.3的結果，將抗TMP-Fc單克隆抗體梯度稀釋，保證血清最小稀釋率為1/20，TMP-Fc終濃度分別為16和80 ng/mL，考察不同藥物濃度下方法的靈敏度。結果見圖3，在同樣單抗?jié)舛认拢琓MP-Fc濃度為16 ng/mL時較80 ng/mL對細胞增殖的抑制效果更為明顯，因此后續(xù)實驗選擇用16 ng/mL（與樣本等體積混合后的濃度）作為檢測TMP-Fc抗體中和活性的藥物濃度。

2.5 TMP-Fc抗體中和活性檢測方法實驗閾值確定

根據(jù)FDA建議[8]，實驗閾值的確定至少需要對5～10個陰性對照樣本的檢測結果進行統(tǒng)計分析。本法采用25個空白猴血清確定CP。TMP-Fc抗體中和活性檢測方法的CP確定共進行3次獨立實驗，結果見表2，CP平均值為23.78%。TMPFc中和抗體檢測的CP確定為23.78%，即抑制率≥23.78%檢測結果判定為陽性，反之則為陰性。

2.6 食蟹猴免疫原性血清樣本的檢測

根據(jù)確立的TMP-Fc抗體中和活性檢測方法，將注射用TMP-Fc與原研藥羅米司亭給予食蟹猴4周恢復期4周免疫原性樣本中結合抗體檢測為陽性的樣本進行中和抗體檢測，結果見表3，中和抗體陽性率檢測統(tǒng)計結果見表4。

注射用TMP-Fc與羅米司亭在300 μg/kg劑量下，TMP-Fc中和抗體個體發(fā)生率為30%（3/10），略低于羅米司亭的40%（4/10），表明二者在免疫原性方面相似。

3 討論

人用生物技術藥物在動物體內有免疫原性，根據(jù)《ICH藥品注冊國際要求》和我國《新生物制品審批辦法》的要求，在進行重復給藥的毒理性研究中，應評價受試動物體內產生的抗體性質，并與毒理/藥理變化聯(lián)系起來[9]。

圖3 TMP-Fc抗體中和活性檢測方法藥物濃度篩選

表3 食蟹猴免疫原性血清樣本中和抗體檢測結果（抑制率）

表4 注射用TMP-Fc組與原研藥羅米司亭中和抗體陽性率

MO7e細胞表面特異性天然表達Mpl，在一定濃度范圍內，TMP-Fc可刺激MO7e細胞增殖。我們首先研究了TMP-Fc促進MO7e細胞增殖的濃度范圍，以及抗TMP-Fc陽性血清對MO7e細胞增殖的影響；在此基礎上確定血清最佳稀釋率，最佳藥物濃度及實驗閾值，建立TMP-Fc抗體中和活性檢測方法，并應用于免疫原性樣本分析，為評價臨床前安全性提供依據(jù)。

在長期毒性實驗中，TMP-Fc與羅米司亭在300 μg/kg劑量下，TMP-Fc中和抗體個體發(fā)生率略低于羅米司亭，表明在免疫原性方面TMP-Fc與羅米司亭相似。

目前治療用重組生物制品的體外生物學活性測定推薦使用細胞法，因細胞法能反映藥物的作用機制。中和抗體檢測方法是基于中和抗體抑制藥物本身的生物學活性而建立的，本研究以MO7e細胞增殖法檢測TMP-Fc生物學活性為基礎，建立藥物中和抗體檢測方法，有效反映藥物及中和抗體的作用機制。雖然細胞法較非細胞法（如配體結合法）變異系數(shù)較大、對基質效應更敏感、試驗過程中干擾因素多，但是更能反映體內作用機制，是目前FDA、CFDA等監(jiān)管機構更推薦的研究方法。因此，開發(fā)一種靈敏的、穩(wěn)定的基于細胞法的中和抗體檢測方法，對于科學評價大分子藥物在臨床前、臨床試驗期間的安全性、有效性具有重要意義。

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