人線粒體轉錄終止因子3基因RNA干擾表達載體的構建篩選與干擾效果評價

梅雯，孫美濤，自加吉，王唯斯，楊勇琴，余敏，熊偉

1.大理大學 基礎醫學院，云南 大理 671000；2.云南大學 生命科學學院，云南 昆明 650091

線粒體轉錄終止因子（mitochondrial transcrip?tion termination factor，MTERF）是廣泛存在于后生動物和植物中，參與線粒體基因復制、轉錄和翻譯的一類高度保守的線粒體DNA（mitochondri?al DNA，mtDNA）結合蛋白，且具有相似的亮氨酸拉鏈結構[1]。研究表明，人類MTERF蛋白家族共有 4 個成員，即 MTERF1～MTERF4[2]。MTERF3 又被稱為線粒體轉錄終止因子結構域1（mitochon?drialtranscription termination domain containing 1，MTERFD1），是MTERF蛋白家族中進化最保守的成員[3]。實驗研究發現，敲除MTERF3基因的純合子小鼠胚胎發育缺陷且導致胚胎死亡，說明MTERF3是哺乳動物胚胎發育過程中必不可少的重要調控因子[4]。Park等[5]首次報道哺乳動物MTERF3是線粒體DNA轉錄的負調控因子，能抑制線粒DNA雙鏈的轉錄水平，減緩細胞能量的生產。同時，Roberti等[6]發現在果蠅D.Mel-2細胞中轉染過表達D-MTERF3基因會導致線粒體基因轉錄水平的下降，也提示MTERF3是線粒體DNA轉錄的負調控因子。Hyvarinen等[7]的研究顯示，在293T細胞內過表達人MTERF3蛋白能抑制mtDNA復制叉的形成，造成細胞內mtDNA拷貝量下降。Wrdenberg等[8]還發現，哺乳動物MTERF3不僅可以負性調節線粒體DNA轉錄，而且可以進一步調節線粒體中核糖體大亞基的組裝，影響核糖體的生物合成。因此，人MTERF3不僅參與mtDNA轉錄，還參與mtDNA的復制和翻譯調控過程。最近的研究顯示，人MTERF3在各種不同類型的實體瘤，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌中均有基因擴增和過表達現象，其蛋白質表達異常可能參與了惡性腫瘤的發生發展和轉移過程[9-11]。在本研究中，我們設計并構建了4個靶向MTERF3基因的短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）干擾表達載體，并轉染宮頸癌HeLa細胞，檢測其對人MTERF3基因mRNA和蛋白質水平的干擾效率，為進一步探討人MTERF3在惡性腫瘤細胞發生發展中的作用機制，以及腫瘤基因治療中的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細胞株由中國醫學科學院昆明生物醫學研究所廖國陽研究員惠贈；克隆宿主菌大腸桿菌DH5α購自Biomed公司；shRNA干擾表達載體psi-U6.1購自Invitrogen公司。

DMEM高糖液體培養基、Opti-MEM液體培養基和胎牛血清購自Gibco公司；限制性核酸內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4DNA連接酶、逆轉錄試劑盒、SYBR premix ExTaq購自TaKaRa公司；0.05%胰蛋白酶、青鏈霉素、Western/IP細胞裂解液、BCA蛋白質定量試劑盒、ECL化學發光液、Li?pofectAMINE 6000轉染試劑購自Beyotime公司；PVDF膜購自Millipore公司；HQ高純度質粒DNA提取試劑盒、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；Trans2K plusDNA marker、EasySee Western marker購自TransGen公司；兔抗人β-tubulin單克隆抗體、兔抗人MTERF3多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自Abcam公司；酵母提取物、DEPC水、蛋白胨及其他生化試劑購自上海生工生物工程公司；PCR引物合成和DNA測序由北京擎科生物工程公司完成。

1.2 人MTERF3基因靶向寡核苷酸的設計和制備

遵循shRNA設計原則[12]，依據MTERF3基因（GenBank ID：51001）的cDNA序列，利用Oligoen?gine在線軟件設計4個shRNA干擾序列（表1）。將候選序列通過美國生物技術信息中心（NCBI）進行Blastn同源性分析，未發現包含該序列的其他基因，說明4個靶點特異性較好。根據psi-U6.1載體要求，設計的每條序列兩端包含EcoRⅠ和BamHⅠ識別位點，由北京擎科生物工程公司合成。

1.3 RNA干擾表達載體的構建

用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切psi-U6.1載體（37℃，3 h），經1%瓊脂糖膠電泳后膠回收載體大片段；將合成的寡聚核苷酸互補鏈分別用退火緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA］溶解，然后置于沸水中自然退火，形成帶有黏端的雙鏈DNA。將退火產物用T4DNA連接酶分別連接入psi-U6.1載體的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點之間，構建4個psi-MTERF3 shRNA干擾表達載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α，每個轉化平板分別挑取4個氨芐西林（Amp）抗性單克隆進行PCR鑒定和DNA測序鑒定。PCR鑒定上游引物為5′-CCGACAACCACTA CCTGA-3′，下 游 引 物 為 5′-CTCTACAAATGTGGT ATGGC-3′；DNA 測序上游引物為 5′-ATGCTTAC CGTAACTTGAAAG-3′，下 游 引 物 為 5′-CTCTACA AATGTGGTATGGC-3′。將構建的4個重組干擾質粒分別命名為psi-hMTERF3-1～psi-MTERF3-4。

1.4 細胞培養與細胞轉染

HeLa細胞用DMEM完全培養基（10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗）于37℃、5%CO2條件下培養，按1×106/孔接種于6孔板，分為空白對照組、陰性對照組（psi-U6.1空載體）、psi-hMTERF3-1組、psi-MTERF3-2組、psi-MTERF3-3組和psi-MTERF3-4組，每組設置3個重復。待細胞至70%～80%匯合時進行轉染，轉染前將DMEM完全培養基更換為無血清培養基，按LipofectAMINE 6000說明書進行脂質體介導的瞬時轉染，48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態，拍攝綠色熒光蛋白的表達情況[13]。

表1 靶向人MTERF3基因的4條shRNA序列信息

1.5 熒光顯微鏡觀察轉染效率

由于質粒攜帶增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因，在質粒轉染細胞后24～48 h，用熒光顯微鏡在488 nm波長紫外光激發下觀察，可發現轉染細胞內由于表達EGFP而發出明亮的綠色熒光，未轉染細胞中則未見任何熒光。經過連續視野計數陽性的細胞數，共觀察20個視野，可計算質粒轉染效率：細胞轉染效率=（表達陽性的細胞數/計數細胞總數）×100%[14]。

1.6 real time RT-PCR檢測MTERF3 mRNA表達水平

瞬時轉染HeLa細胞48 h后，用TRIzol試劑提取各組細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，通過real time RT-PCR檢測細胞樣品中目的基因MTERF3和內參基因GAPDH的表達量，實驗重復3次。目的基因MTERF3及內參基因GAPDH的引物序列分 別 為 MTERF3-F（5′-ATATCCTCTGACAATTGC T-3′）和 MTERF3-R（5′-TCCACTGAAAAGTTCAG C-3′）、GAPDH-F（5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT C-3′）和 GAPDH-R（5′-GAGATGGTGATGGGATTT C-3′）。根據real time RT-PCR反應曲線得到各樣品目的基因和內參基因的數值循環數值（Ct），采用Ct方法進行相對定量。以轉染陰性干擾載體的樣品為對照，比較各瞬時轉染干擾載體組樣品目的基因的表達，并計算干擾效率[15]。ΔΔCt=（待測樣品目的基因的Ct平均值－待測樣品內參基因的Ct平均值）－（對照樣品目的基因的Ct平均值－對照樣本內參基因的Ct平均值）?；虻谋磉_量 F=2-ΔΔCt，目的基因的沉默效率=1-2-ΔΔCt。

1.7 Western印跡檢測MTERF3蛋白質表達水平

瞬時轉染HeLa細胞48 h后，用Western/IP細胞裂解液提取各組細胞總蛋白質，再用BCA總蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度后上樣，進行SDS-PAGE，電泳至溴酚藍達到分離膠底部，半干轉印法轉膜后，常溫下用含5%脫脂奶粉的TBST溶液中于脫色搖床上輕輕搖動封閉1 h。室溫孵育一抗，一抗為兔抗人MTERF3多克隆抗體（1∶1000）或兔抗人β-tubulin單克隆抗體（1∶2000），將膜條放置平皿中于脫色搖床上輕輕搖動孵育2 h；用TBST（含20%Tween-20）緩沖液搖床搖動洗膜2次，每次10 min；再進行二抗孵育，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5000稀釋），同上述方法室溫孵育1 h，TBST洗膜2次，每次10 min；最后加ECL發光劑作用約15 s，用化學發光成像儀曝光并拍照。

1.8 統計學分析

用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，定量資料以x±s表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD?t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義，P≤0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 人MTERF3基因shRNA干擾載體的構建與鑒定

將合成的4條寡聚核苷酸片段與psi-U6.1載體連接并轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單克隆進行PCR鑒定，重組質?？傻玫?15 bp的產物，空質粒擴增得到376 bp的產物，結果顯示，PCR擴增產物大小均與預期片段一致，證明已插入目的片段（圖1）。將含重組質粒的大腸桿菌擴增后提取質粒，并將陽性克隆送北京擎科公司測序，經過DNA測序和Blastn比對分析，表明重組克隆中插入目的片段序列與設計的寡聚單鏈DNA序列完全一致，無堿基突變（圖2）。以上結果證實4個重組干擾表達載體均構建成功，分別命名為psi-MTERF3-1、psi-MTERF3-2、psi-MTERF3-3和psi-MTERF3-4。

2.2 轉染后干擾載體psi-MTERF3在細胞中的熒光觀察

干擾載體瞬時轉染HeLa細胞48 h后，在熒光顯微鏡觀察下觀察，各組細胞均可見較多綠色熒光蛋白表達（圖2），提示細胞中有轉染的外源基因表達，說明干擾載體已成功地瞬時轉染HeLa細胞。經多視野陽性細胞計數，計算重組質粒轉染效率為75%±4.6%。

2.3 干擾表達載體對MTERF3基因 mRNA的沉默效率

以未轉染的HeLa細胞為空白對照，real time RT-PCR檢測HeLa細胞分別轉染4個shRNA干擾載體和psi-U6.1（陰性對照）后人MTERF3基因mRNA的表達情況。結果顯示，與對照組相比，陰性對照組不能降低MTERF3mRNA的表達，4個shRNA干擾表達載體均能夠不同程度地降低MTERF3mRNA的表達，干擾效率分別為51.3%、58.0%、50.2%和70.1%，提示psi-MTERF-3、psi-MTERF-4質粒的干擾效果最優（圖4）。

2.4 干擾表達載體對MTERF3蛋白表達的沉默效率

以未轉染的HeLa細胞為空白對照，Western印跡檢測HeLa細胞分別轉染4個shRNA干擾載體、psi-U6.1（陰性對照）后人MTERF3蛋白的表達。結果顯示（圖5），各組的β-tubulin表達未受影響，轉染空載體的HeLa細胞中MTERF3蛋白的表達未見差異，轉染4個shRNA干擾表達載體后的干擾效率分別為52.3%、60.1%、50.2%和72.2%，psi-MTERF-3、psi-MTERF-4重組載體對MTERF3蛋白表達的抑制最有效。

圖1 psi-MTERF3質粒圖譜與PCR鑒定圖

圖2 4個psi-MTERF3質粒的DNA測序圖譜

3 討論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在生物體細胞內，由反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA），特異性抑制靶基因表達的現象，是一種轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[16]。RNAi是在RNA水平調節基因表達的一種方式，對細胞防御病毒的感染、修復遺傳損傷及調節正?；蚬δ芫哂兄匾饔?。小干擾RNA（small interfer?ence RNA，siRNA）介導的轉錄后水平的基因沉默針對靶向基因的外顯子序列，而對其啟動子或內含子序列沒有效應[17]。與核酶技術、翻譯技術等基因沉默技術相比，RNAi具有高特異性、高效性、高穩定性、可傳播性的特點，而且其抑制效應可垂直傳遞多代[18]。因此，RNAi技術在基因功能研究和基因治療方面的應用越來越多。

圖3 干擾質粒轉染HeLa細胞后綠色熒光蛋白表達情況

圖4 干擾載體轉染HeLa細胞后MTERF3 mRNA的相對表達n=3；*P＜0.05

近年來，隨著人們對線粒體轉錄調控機制和人類線粒體遺傳病研究的深入，MTERF蛋白家族日益受到重視。人MTERF3主要抑制mtDNA的表達，可以降低細胞能量的合成，為糖尿病、心臟病、帕金森癥和惡性腫瘤等疾病的治療開辟新思路。人MTERF3是線粒體基因表達和氧化磷酸化活性的負調控因子，其作用類似于細胞癌基因，對腫瘤細胞的生長及轉移具有促進作用[5,11]。現有研究表明，人MTERF3在非小細胞肺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達，但由于樣本量小、抽樣誤差等原因，其結論有待進一步證實[9-11]。前期研究中，我們利用Oncomine和TCGA數據庫分析人MTERF3基因mRNA在宮頸癌組織及正常宮頸組織中的表達情況，結果顯示人MTERF3基因在宮頸癌組織中的mRNA表達水平顯著高于正常宮頸組織（P＜0.05），進一步證實MTERF3基因在腫瘤組織中高表達，促進腫瘤的生長和增殖。

shRNA是由核酸內切酶將外源或內源dsRNA加工成21～23 nt的雙鏈RNA，是RNAi的中間產物，也是RNAi的關鍵因素[19]。本研究中所用的psi-U6.1是一個能在真核細胞中表達的shRNA干擾載體，且攜帶EGFP報告基因，可用于觀察和計算細胞的轉染效率。根據RNAi設計原則，本研究設計4條shRNA序列進行篩選，構建靶向MTERF3基因的shRNA真核表達載體，其轉錄產物可在細胞內形成shRNA，此shRNA隨后被加工成siRNA而降解靶基因mRNA，從而達到阻斷靶基因表達的目的。將4個重組質粒用脂質體介導瞬時轉染HeLa細胞，分別以GAPDH和β-Tubulin為內對照，MTERF3基因在mRNA水平和蛋白質水平均被顯著抑制（P＜0.05）。通過檢測和篩選發現，4條特異性shRNA序列中，以psi-MTERF-3、psi-MTERF-4轉染后對MTERF3基因的干擾效果最好，可以作為研究靶向MTERF3的RNAi的優先考慮序列，也為以MTERF3為靶基因的RNAi腫瘤治療提供了可靠的實驗基礎，但還須進行深入的藥物實驗及動物體內實驗來確證其有效性。隨著分子生物學的發展，對MTERF3基因的研究不斷深入，但主要側重于線粒體轉錄調控方面，有關MTERF3表達與線粒體疾病的關聯，以及MTERF3表達與人類惡性腫瘤發生發展的關系還待深入探討。后續，我們擬從干擾MTERF3基因表達對腫瘤細胞線粒體氧化磷酸化活性和細胞惡性生物學行為的影響等方面展開深入研究，為進一步闡明MTERF3基因在惡性腫瘤發生發展中的作用機制奠定基礎。

圖5 干擾載體轉染HeLa細胞后MTERF3蛋白的相對表達n=3；*P＜0.05

[1] 熊偉,左紹遠,余敏.線粒體轉錄終止因子蛋白家族在線粒體基因表達中的調節作用[J].中國生物化學與分子生物學報,2015,31(3):223-231.

[2] 黃淑顏,丘式浚,陳家逸,等.線粒體轉錄終止銀子(mTERF)蛋白家族的研究進展[J]. 生命科學研究,2016,20(5):455-459.

[3] Roberti M,Polosa P L,Bruni F,et al.MTERF fac?tors:a multifunction protein family[J].BioMolCon?cepts,2015,1(2):215-224.

[4] Roberti M,Polosa P L,Bruni F,et al.The MTERF family proteins:mitochondrialtranscription regulators and beyond[J].Biochim BiophysActa,2009,1787(5):303-311.

[5] Park C B,Asin-Cayuela J,Cámara Y,et al.MTERF3 is a negative regulator of mammalian mtDNA transcrip?tion[J].Cell,2007,130(2):273-285.

[6] Roberti M,Bruni F,Loguercio Polosa P,et al.MTERF3,the most conserved member of the mTERF-family,is a modular factor involved in mitochondrial protein syn?thesis[J]. Biochim Biophys Acta, 2006,1757(9-10):1199-1206.

[7] Hyv?rinen K,Pohjoism?ki J L,Holt I J,et al.Overex?pression of MTERFD1 or MTERFD3 impairs the com?pletion of mitochondrial DNA replication[J].Mol Biol Rep,2011,38(2):1321-1328.

[8] Wrdenberg A,Lagouge M,Bratic A,et al.MTERF3 regulates mitochondrial ribosome biogenesis in inverte?brates and mammals[J]. PLoS Genet, 2013,9(1):e1003178.

[9] 自加吉,楊勇琴,孫美濤,等.人線粒體轉錄終止因子3在胃癌組織中的表達及其意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2017,33(1):84-86.

[10]自加吉,楊勇琴,孫美濤,等.非小細胞肺癌中人線粒體轉錄終止因子3的表達及臨床病理學意義[J].醫學研究生學報,2017,30(2):160-164.

[11]Zhang C,Wu N,Gao F,et al.MTERFD1 functions as an oncogene[J].Oncotarget,2016,8.doi:10.18632/on?cotarget.11140.

[12]Krichevsky A M,Kosik K S.RNAi functions in cul?tured mammalian neurons[J].Proc NatlAcad Sci USA,2002,99(18):11926-11929.

[13]楊聰翀,朱麗芳,寧天云,等.MT1-MMP miRNA干擾載體的構建及沉默效果評價[J].口腔生物醫學,2012,3(3):117-123.

[14]宗鑫,胡汪洋,汪以真.豬髓樣分化因子MyD88特異性shRNA干擾載體的構建篩選及干擾效果評價[J].中國生物工程雜志,2015,35(7):1-7.

[15]黃美鳳,方伯言.人NHE-1基因miRNA干擾載體構建、鑒定及干擾效應評價[J].中國現代醫學雜志,2010,10(18):2721-2724.

[16]Kasschau K D,Carrington J C.A counterdefensive strategyofplantviruses:suppression ofposttranscrip?tional gene silencing[J].Cell,1998,95(4):461-470.

[17]石智,符立梧.RNAi及其在腫瘤研究中的應用[J].生物化學與生物物理進展,2004,31(6):492-499.

[18]Wassenegger M.The role of the RNAi machinery in heterochromation formation[J].Cell,2005,122(1):13-16.

[19]于冬梅,郝立君,郭小英,等.人細胞周期蛋白cyclin D1基因RNAi表達載體的構建與鑒定[J].中國腫瘤,2007,16(12):1008-1011.