B型肉毒毒素輕鏈的高效制備及活性鑒定

羅森，陳芳紅，李濤，王慧

1.遵義醫(yī)藥高等專科學校，貴州 遵義 563002；

2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧環(huán)境中產生的外毒素，是目前毒性最強的一種生物毒素，對人的致死量約為0.1 μg。根據其抗原性的不同，可將肉毒毒素分為A～G共7個血清型，人類的肉毒中毒主要由A、B和E型引起[1]。肉毒毒素是相對分子質量（Mr）約為150 000的蛋白質，由一條Mr約50 000的輕鏈（LC）和一條Mr約100 000的重鏈（HC）通過二硫鍵聯(lián)結在一起，具有鋅離子依賴的催化活性結構域位于毒素的LC中[2-3]。肉毒毒素的致病機制是由HC結合到后膽堿神經能細胞并易位通過細胞膜進入神經細胞釋放出LC[4-6]。LC作為一種鋅內肽酶，選擇性切割神經細胞內底物SNARE蛋白。每個血清型的輕鏈都切割特異的底物蛋白，其中B型肉毒毒素特異性裂解SNARE蛋白中VAMP-2的Q76-F77位點[7-9]，從而阻斷神經遞質乙酰膽堿的釋放，引起肌肉松弛麻痹、呼吸肌麻痹，甚至導致人畜中毒死亡。在我國許多省區(qū)，時有A型和B型肉毒中毒發(fā)生[10-14]。

由于肉毒毒素具有劇毒性，穩(wěn)定性差，其操作面臨潛在的健康危害甚至生命危險。為了避免這些問題，并能夠經濟高效地得到有活性的穩(wěn)定的肉毒毒素LC，作為試劑應用于肉毒毒素酶類抑制劑高通量檢測方法的研究，食品衛(wèi)生、進出口檢疫檢驗，以及對美容醫(yī)療用肉毒毒素活性分析和檢測，我們通過基因克隆技術，從B型肉毒梭菌中調取BoNT/B LC基因，在大腸桿菌中重組表達，通過SDS-PAGE對重組蛋白進行鑒定，親和純化后，利用底物與BoNT/B的催化活性做對比分析了重組蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）Rosetta感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；表達質粒pET-22b由本室保存；B型肉毒梭菌和BoNT/B由本室制備保存；底物CYB［CFP-VAMP（33-94）-YFP］[15]由本室制備保存；DNA標志物、蛋白質相對分子質量標志物、質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶XhoⅠ和NdeⅠ購自New England Biolabs公司；培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；IPTG購自Promega公司；引物及基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；HisTrap FF柱（5 mL）購自GE Healthcare公司。

1.2 引物設計與合成

根據B型肉毒毒素序列（GanBank：M81186.1）中的LC片段及載體序列，設計和合成上游引物P3（5′-CATATGCCAGTTACAATAAATAATTTT-3′）和 下游 引物 P4（5′-CTCGAGTTTAACACTTTTACA CATT-3′），分別引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點（下劃線部分）。

1.3 目的基因的克隆和原核表達載體pET-22b-BoNT/B LC的構建與鑒定

厭氧培養(yǎng)B型肉毒梭菌后離心收集菌體，用50 μL 0.01 mol/L Tris-HCl（pH7.4）重 懸 ，加 入50 μL 0.5 mol/L KOH，96℃加熱 10 min，加入100 μL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.5），12 000 r/min離心10 min，取上清10 μL作為模板進行PCR擴增。25 μL PCR擴增體系包括H2O 17.5 μL，緩沖液 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，Taq酶 1 μL，模板 1 μL。PCR 擴增反應條件：95℃ 3min；94℃ 30 s，53℃40 s，72℃ 1.5min，30次 循 環(huán) ；72℃ 延 伸 10 min。用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物后連接T載體，轉化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定的陽性重組質粒用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收BoNT/B LC片段，與經同樣雙酶切處理的pET-22b載體用T4DNA連接酶連接，構建原核表達載體pET-22b-BoNT/B LC，轉化大腸桿菌DH5α,挑選陽性菌落提取質粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序鑒定。

1.4 重組蛋白BoNT/B LC的誘導表達

將鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）Rosetta感受態(tài)細胞，挑選陽性菌落接種于含氨芐西林（Amp）（100 mg/L）的 LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)，按1∶100的比例轉接于3 L三角燒瓶中擴大培養(yǎng)，待菌體D600nm為0.8左右，加入IPTG至1 mmol/L，調節(jié)溫度為20℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)20 h，誘導結束后4℃、6000 r/min離心5 min收集沉淀菌體，用結合緩沖液（A液）重懸，放置冰上進行超聲波破碎處理，4℃、12 000 r/min離心10 min，SDS-PAGE分析上清和沉淀中的目的蛋白。

1.5 重組蛋白BoNT/B LC的純化

取細菌培養(yǎng)液，4℃、6000 r/min離心收集菌體，菌體沉淀重懸于結合緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH7），超聲波破碎處理后取上清，用HisTrap FF柱上樣，用10個柱床體積的結合緩沖液平衡柱，然后用洗脫緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH7.4）線性梯度洗脫，收集洗脫樣品用SDS-PAGE分析，采用Bradford法對純化產物定量，純化后的重組蛋白透析于緩沖液（50 mmol/L HEPES，pH7.5）中，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組蛋白BoNT/B LC的活性和穩(wěn)定性檢測

重組蛋白BoNT/B LC與CYB在反應液（50 mmol/L HEPES，2.5 mmol/LDTT，10 μmol/L Zn?Cl2，pH7.4）中于 37℃反應 30 min，同時設定一組不加BoNT/B LC的陰性對照和一組加BoNT/B全毒素的陽性對照。經20%SDS-PAGE后考馬斯亮藍顯色檢測切割情況，分析BoNT/B LC的活性。用 BoNT/B LC（10 nmol/L）切割 2～100 μmol/L不同濃度的CYB，切割反應時間為20 min，加入SDS-PAGE上樣緩沖液終止反應，SDS-PAGE檢測，對電泳圖用Chemi Doc XRS成像系統(tǒng)（Bio-Rad）光密度分析法測定，由CYB蛋白切割和未切割的百分比計算得到動力學參數。將純化蛋白分別保存于23℃、4℃和-20℃，每10 d檢測一次重組蛋白的活性和自身降解情況。

2 結果

2.1 BoNT/B LC的基因克隆和表達質粒構建

圖1A為通過PCR擴增獲得的BoNT/B LC基因片段，預期大小為1326 bp，與電泳結果相符。測序結果表明擴增產物與GenBank中報道的基因序列一致性為99%。圖1B顯示NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-22b-BoNT/B LC后的產物，切割產物大小與PCR結果一致，提示目的基因正確插入pET-bn22b表達載體中。

2.2 重組蛋白BoNT/B LC在大腸桿菌中的誘導表達與純化

pET-22b-BoNT/B LC質粒轉化表達菌株BL21 Rosetta感受態(tài)細胞，在IPTG誘導下表達，SDS-PAGE分析顯示，與未誘導菌相比，誘導菌上清在Mr約50 000處有誘導表達的蛋白帶，與預期大小相符（圖2），表明目的蛋白為可溶性表達。分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達量占細菌總蛋白的30%左右，經SDS-PAGE分析，通過HisTrap FF柱純化的蛋白在Mr約50 000處有一條單一的蛋白帶，與預期大小相符，純度在95%以上，提示得到較高純度的目的蛋白（圖3）。

2.3 重組蛋白BoNT/B LC的活性檢測和穩(wěn)定性檢測

BoNT/B LC可特異性識別裂解其底物VAMP-2蛋白的 Q76-F77[20]。將不同濃度（1、2、10 nmol/L）的BoNT/B和純化制備得到的蛋白分別與CYB在反應液中于37℃孵育30 min，SDS-PAGE分析反應結果如圖4。與BoNT/B一樣，制備的蛋白能酶解CYB后產生與預期相符的2條蛋白片段，表明制備得到的蛋白即為重組蛋白BoNT/B LC。動力學參數測定結果表明，BoNT/B LC酶解CYB 的Km和kcat值分別為 17.6±2.6 μmol/L 和4.16±0.28/s，而BoNT/B酶解CYB的Km和kcat值分別為15.9±2.4 μmol/L 和 1.43±0.72/s。

圖1 BoNT/B LC PCR產物（A）和pET-22b-BoNT/B LC表達載體（B）的鑒定

圖2 目的蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）Rosetta中的表達

穩(wěn)定性檢測結果顯示：BoNT/B LC透析于緩沖液（50 mmol/L HEPES，pH7.5）中，于 23℃條件下保存30 d具有85%的酶活性，4℃保存30 d具有100%的酶活性。

圖3 純化后重組目的蛋白的檢測

圖4 SDS-PAGE分析目的蛋白和BoNT/B與CYB的反應結果

3 討論

由于肉毒毒素是劇毒物質，對其操作面臨潛在的危險，同時還無法從天然的肉毒毒素中有效分離HC和LC片段。LC已被證實是治療肉毒毒素中毒的關鍵藥靶，開發(fā)高效BoNT LC抑制劑是當前研究的熱點領域[16-19]。在基于肉毒毒素活性的分析方法中，小鼠生物檢測仍是目前惟一被公認的確認BoNT的方法[20]。但小鼠生物檢測本身也有缺點，如檢測成本較高、檢測需4 d時間、檢測過程中可能有非特異性死亡、對大批量的樣本進行檢測存在困難等。針對BoNT LC抑制劑開發(fā)的大量樣本的初步篩選，建立高通量的體外檢測方法，能夠極大地減少檢測時間和工作量。本研究的目的是利用基因工程手段高效制備BoNT/B LC重組蛋白，為后續(xù)的BoNT LC抑制劑高通量體外檢測方法的測試研究奠定基礎。

對于BoNT/B LC的純化制備，與Gilsdorf[21]等曾采用陽離子交換色譜法不同，我們通過在重組蛋白的C端加上組氨酸標簽，利用HisTrap FF柱進行親和純化，通過一次過柱純化得到高純度的目的蛋白，純化方法簡單容易。與曾有研究報道的BoNT/B LC的原核表達及純化相比，為了提高目標蛋白的表達產量，選擇攜帶稀有密碼子的表達菌株大腸桿菌 BL21 Rosetta，比 BL21（DE3）菌株的表達量提高約2倍，目的蛋白的表達量達細菌總蛋白的30%左右；采用20℃低溫誘導并延長誘導時間，比37℃誘導的表達量提高5倍以上，且包涵體更少，可能是由于低溫條件更有利于該蛋白的表達和正確折疊，表達的目的蛋白絕大部分存在于菌體裂解液上清中。酶活分析證明所制備的重組蛋白LC的酶活性略高于全毒素，這可能是由于全毒素中LC的活性部位被包圍在HC的易位域帶中，而單獨的LC與全毒素中的LC相比可暴露更多的活性位點。類似結果在BoNT/A LC中也有報道[22-23]。

本研究獲得的BoNT/B LC重組蛋白具有高活性、高穩(wěn)定性，制備高效，安全無毒，為后續(xù)BoNT/B LC抑制劑高通量體外檢測方法的研究和BoNT/B LC抑制劑的篩選奠定了基礎。

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