人p65真核表達載體的構建及鑒定

楊莞琦，王瑞峰，程龍，牛暢

1.首都師范大學 生命科學學院，北京 100048；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100850

作為抗感染免疫的關鍵通路，NF-κB信號通路能夠被多種信號，包括多種病原的組分如脂多糖，前炎性細胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素 1（IL-1）及絲裂原等活化[1]。NF-κB家族包括 5個成員，即 RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p105-p50）和 NF-κB2（p100-p52），它們的 N端均包含一個Rel同源結構域（RHD），這一大約包含300個氨基酸殘基的同源序列能夠介導其與DNA結合及二聚化[2]。在正常細胞中，NF-κB/Rel與IκBa、IκBb或 IκBg結合，以非活性形式被阻滯在胞質中。當IκB激酶（IKK）復合物活化時，磷酸化IκB家族成員，使其泛素化并被蛋白酶體降解[3-4]。IκB 降解后 NF-κB/Rel被釋放，進一步由翻譯后修飾（磷酸化、乙?；?、糖基化）作用激活，并轉移到細胞核內，在核內單獨或聯合其他轉錄因子（AP-1、Ets和Stat）共同誘導下游基因（如IL-6、TNFα、IL-12等）轉錄，這些下游分子發揮不同的生物學功能，包括先天和適應性免疫、炎癥、應激反應、B細胞發育和淋巴器官形成[5-6]。在真核細胞中，NF-κB主要以p50-RelA（p65）異源二聚體的形式存在[7]。已有報道，NF-κB發揮功能需要與其他蛋白的相互作用[8]。為了尋找到更多的NF-κB相互作用蛋白，我們構建了pcDNA3.1-Myc-p65真核表達載體，并對該載體的定位和活性進行了驗證，為進一步篩選NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T細胞、HeLa細胞、真核表達載體pcDNA3.1-Myc由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態細胞和LipofectAMINE 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；PCR試劑、限制性內切酶、T4DNA連接酶及DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司；DNA純化、質粒提取、螢光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司；Vigofect轉染試劑和Western印跡發光底物試劑盒購自威格拉斯生物技術（北京）有限公司；DMEM培養基和胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；DAPI染料購自Sigma公司；Myc抗體、GAPDH抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 pcDNA3.1-Myc-p65真核表達載體的構建

根據pcDNA3.1-Myc載體圖提供的酶切位點，分別在上、下游引物中加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。根據文獻報道[9]的p65編碼序列設計上游 引 物（5′-GAATTCTGGCTCGTCTGTAGTGCACG C-3′）和下游引物（5′-GGATCCGGAGCTGATCTG ACTCAGCAG-3′），引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成。利用PCR技術，以乳腺癌文庫為模板擴增p65基因的編碼序列［兩步法PCR擴增條件：98℃預變性1 min，30個循環反應（98℃ 10 s，68℃ 2 min），4℃保存］。瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物大小正確后用膠回收試劑盒回收PCR產物，然后將分別經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切形成粘性末端的PCR片段和pcDNA3.1-Myc空載體，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃培養12 h后挑取LB平板上單個可見菌斑進行菌液PCR鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示為陽性的克隆接種于液體LB培養基，37℃培養12 h并提取質粒，所得質粒再經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定結果正確的陽性克隆送樣品測序，序列測定由北京博邁德科技發展有限公司完成。

1.3 Westrn印跡檢測轉染基因的表達

將含10%胎牛血清的DMEM培養基培養的HEK293T細胞接種于六孔板，待細胞密度達60%～80%時，按照VigoFect轉染試劑說明書轉染對照空載體和重組質粒，48 h后觀察轉染效率并收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解收集到的細胞，蛋白定量后取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE并轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉常溫下封閉1 h，分別與按一定比例稀釋的抗Myc抗體和抗GAPDH抗體室溫孵育2 h或4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后與HRP標記的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗孵育1 h，TBST漂洗3次后加入發光底物孵育5 min，在暗室中用X線膠片曝光顯影。

1.4 免疫熒光

將宮頸癌HeLa細胞接種于放置了圓形玻片的24孔板中，細胞密度達40%～50%時，用LipofectAMINE 2000轉染對照空載體和重組質粒，24 h后加入濃度為10 ng/mL的TNFα刺激5 h，棄去細胞培養液，PBS清洗圓形玻片后用3%甲醛（PBS配制）室溫固定20 min，PBS洗去甲醛后加入裂解液（0.5%Triton X-100+1%羊血清）置于冰上通透 10 min，用 1%NGS（PBS配制）封閉 30 min，Myc抗體4℃孵育過夜，用1%NGS洗3次后加入熒光素標記的二抗αm448室溫孵育2 h，用PBS洗3次后加入DAPI染核5 min，PBS清洗后滴加3～5 μL防淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照，4℃暗盒內避光保存。

1.5 螢光素酶活性檢測

HEK293T細胞接種于24孔細胞培養板中，待細胞密度達60%～80%時，將重組質粒和NF-κBLuc螢光素酶報告基因質粒按所需比例和用量轉染HEK293T細胞，同時每孔均共轉染海腎螢光素酶對照報告基因質粒pRL-TK消除轉染效率的誤差。轉染24 h后，加入濃度為10 ng/mL的TNFα刺激5 h，收集細胞加入細胞裂解液，取30 μL裂解上清液加入等體積的螢光素酶檢測試劑，用化學發光檢測儀檢測螢光素酶活性；繼續加入30 μL終止液，淬滅反應同時啟動海腎螢光素酶反應，測定海腎螢光素酶活性。每組實驗均進行3次重復，取平均值做圖。

2 結果

2.1 真核表達載體的構建和鑒定

PCR擴增p65基因片段，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后在約1600 bp處可見明顯的擴增條帶，與擴增片段大小基本一致。用DNA回收試劑盒回收，將PCR產物與pcDNA3.1-Myc載體同時用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單克隆擴增p65基因片段，能夠擴增出p65基因的克隆為陽性克隆，培養后提取質粒進一步雙酶切鑒定，能夠切出p65基因片段的克隆確定為陽性克隆，如圖1酶切后得到2條帶，約1600 bp的條帶是目的條帶，約5000 bp的條帶是空載體條帶。將陽性克隆測序，證實pcDNA3.1-Myc-p65重組質粒插入片段的序列與已報道的p65序列完全一致，表明p65的真核表達載體構建成功。

2.2 Western印跡鑒定pcDNA3.1-Myc-p65的表達

將構建的pcDNA3.1-Myc-p65重組質粒、對照空載體pcDNA3.1-Myc（陰性對照）、pcDNA3.1-Myc-p53（陽性對照）分別瞬時轉染HEK293T細胞，48 h收集細胞并用RIPA裂解，提取細胞總蛋白，抗Myc抗體Western印跡檢測pcDNA3.1-Mycp65蛋白的表達。從圖2可見，轉染pcDNA3.1-Myc空載體的細胞沒有條帶，轉染pcDNA3.1-Myc-P53質粒的細胞在相對分子質量53 000處有條帶，轉染pcDNA3.1-Myc-p65質粒的細胞在65 000處有特異條帶，說明構建的pcDNA3.1-Myc-p65重組質粒在蛋白水平得到表達。

2.3 pcDNA3.1-Myc-p65免疫熒光定位

轉染了pcDNA3.1-Myc-p65重組質粒的宮頸癌HeLa細胞，經固定、封閉、裂解后用Myc和αm488抗體孵育，DAPI核染色后封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。由圖3可知，沒有TNFα刺激時，p65主要分布在細胞質中，胞質中的IκB與p65結合抑制了其活性，圖中藍色為DAPI標記的細胞核；加入TNFα后，大部分p65進入細胞核，因為TNFα激活了IKK復合物，該復合物能夠磷酸化IκB家族成員，使其泛素化并被蛋白酶體降解，IκB降解后p65被釋放，進一步由翻譯后修飾（磷酸化、乙?；?、糖基化）作用激活，并轉移到細胞核內，激活下游基因的轉錄。

2.4 pcDNA3.1-Myc-p65螢光素酶報告基因活性檢測

圖1 pcDNA3.1-Myc-p65載體的酶切鑒定

圖2 pcDNA3.1-Myc-p65載體的蛋白表達鑒定

pcDNA3.1-Myc-p65重組質粒和NF-κB-luc報告基因共轉染HEK293T細胞，24 h后加入10 ng/mL的TNFα刺激5 h，收集細胞，檢測螢光素酶活性。結果如圖4，p65和TNFα均可以明顯激活NF-κB的轉錄，并且p65是以TNFα不依賴的方式激活NF-κB信號通路活性。

3 討論

病原相關分子模式（pathogen-associated mo?lecular patterns，PAMP）如脂多糖等，炎性細胞因子如TNF、IL-1及絲裂原等信號結合細胞膜上的受體，通過一系列的分子傳遞，最終激活NF-κB信號通路的轉錄因子，其中p65被認為是最重要的轉錄因子。p65發揮功能需要結合一些蛋白，這些蛋白有的促進p65轉錄活性的發揮，被稱為共激活因子，如 p300[10]、AEG-1[11]等；有的抑制 p65的轉錄活性，被稱為共抑制因子，如RAC3[12]、周期蛋白D1[13]、ING4[14]等。為了尋找更多的共調節因子，我們構建了p65的真核表達載體pcDNA3.1-Myc-p65，酶切鑒定和蛋白表達鑒定均提示載體構建成功。

接下來將pcDNA3.1-Myc-p65轉染細胞，對其轉錄翻譯出來的Myc-p65蛋白進行了初步驗證。首先通過免疫熒光檢測其定位，發現Myc-p65蛋白主要定位于細胞質中，在加入TNFα后主要定位于細胞核內。TNFα能激活IKK復合物，活化后的IKK復合物又可以磷酸化NF-κB的抑制分子IκB,磷酸化的IκB蛋白被泛素連接酶復合物SCFβTrCP泛素化，并最終被蛋白酶體降解[4]。這樣，原本被結合并滯留在細胞質中的轉錄因子（p65、c-Rel、RelB、p50、p52等)可以進入細胞核，開啟下游基因的轉錄。上述結果證實構建的Myc-p65的定位與文獻報道一致。其次，我們檢測了Myc-p65對NF-κB報告基因活性的調節，發現Myc-p65能促進報告基因的活性，且這種促進作用不依賴于TNFα，這與p65的已知功能一致。上述結果均提示Myc-p65能夠發揮內源p65相同的功能，可以用于后續相互作用蛋白的篩選。

圖3 pcDNA3.1-Myc-p65在宮頸癌HeLa細胞中的定位

圖4 pcDNA3.1-Myc-p65激活NF-κB的轉錄活性

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