五指山小型豬不同器官內豬內源性反轉錄病毒的存在與表達

范瑞，賈俊婷，鐘亞迪，馬麗敏，馮書堂，馬玉媛，章金剛

1.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 衛(wèi)生勤務與血液研究所，北京 100850；3.北京市蓋蘭德生物科技有限公司，北京 100007

異種移植為緩解臨床同種供體移植物短缺問題提供了一種有效的方法。豬在解剖結構、生理特征、營養(yǎng)和新陳代謝等方面與人非常相似，因此被認為是最適合于異種移植的供體。然而異種移植仍然存在動物源性產(chǎn)品向人類傳播病原體的潛在風險，其中豬內源性反轉錄病毒（por?cine endogenous retrovirus，PERV）可整合在所有豬種基因組中[1]，且已被證實在體外能夠感染人源細胞[2]，因此被認為是豬細胞、組織或器官移植中最重要的病原體。雖然迄今沒有證據(jù)表明在接受豬異種移植的非人靈長類動物或人類患者中存在PERV感染[3]，但全面監(jiān)測PERV在不同器官內的分布和表達仍十分必要。國外科學家已對大白豬（Large-white pig）、尤克坦小型豬（Yu?catan micropig）等豬種不同器官中PERV的存在與表達情況進行了探索，但對中國特有小型豬的研究鮮有報道。

五指山小型豬是中國特有小型豬的一種。它具有體型小、性成熟早、產(chǎn)仔率高等優(yōu)點，且該近交系連續(xù)近親交配達到20代以上，近交系數(shù)大于99%，基因純合度高，遺傳穩(wěn)定，可有效消除異種移植中種群繁殖的大多數(shù)病原體[4]，有望為異種移植提供合適供體。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)五指山小型豬具有PERV基因序列拷貝數(shù)較低[5]，且無PERV-C亞型等特點[6]。本實驗中我們將通過分析五指山小型豬不同器官內基因組DNA（ge?nomic DNA，gDNA）、mRNA中PERV的存在與表達情況，為豬-人異種移植器官選擇積累重要的基礎性數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

五指山小型豬近交系4頭，來源于北京市蓋蘭德生物科技有限公司，各取其心、肝、脾、肺、腎、胸腺標本迅速置于液氮中保存。

基因組DNA純化試劑盒購自Promage公司；RealMasterMix（SYBR Green）購自Tiangen公司；實時熒光定量PCR儀iQ5購自Bio-Rad公司；紫外分光光度計DU-640購自Beckman公司。

1.2 gDNA和總RNA提取

從液氮中取出凍存標本，在用液氮冷卻的研缽中研磨成粉末狀，用gDNA純化試劑盒提取五指山豬各器官的gDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。最終得到的各器官gDNA用紫外分光光度計測量濃度和純度，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

用TRIzol法從研磨成粉末狀的標本中提取各器官的總RNA，用紫外分光光度計測量總RNA濃度和純度，儲存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 反轉錄合成cDNA第一條鏈

以細胞總RNA為模板進行反轉錄，采用20 μL 體系［9 μL 細胞總 RNA，1 μL Oligo（dt）15，4 μL AMV 5×緩沖液，4 μL 10 mmol/L dNTPs混合物，20 U RNasin，12 U AMV反轉錄酶］，室溫放置10 min后42℃水浴1 h，在AMV反轉錄酶的作用下反轉錄合成cDNA第一條鏈。

1.4 PCR及RT-PCR檢測PERV的存在與表達

分別以4頭豬不同器官的gDNA和cDNA為模板,用本室前期建立的PERV核酸檢測方法[7-8]，對PERV結構基因gag、pol、env進行PCR擴增，預期擴增片段大小分別為361、150和265 bp。

50 μL PCR 體系包括約 100 ng gDNA，10×PCR 緩沖液 5 μL，10 mmol/L dNTPs混合物 4 μL，上、下游引物各 10 pmol，rTaqDNA 聚合酶2.5 U，加無菌去離子水至50 μL。擴增程序：94℃變性 5 min；94℃ 30 s，55℃（gag）/57℃（pol）/58℃（env） 45 s，72℃ 30 s，循環(huán) 30次；72℃延伸5 min。以五指山豬PBMC的gDNA或cDNA為陽性對照，以無模板為陰性對照（negative control，NTC）。

1.5 不同器官中PERV-pol表達的相對定量分析

1.5.1 標準品質粒的制備 根據(jù)本室前期測定的五指山豬來源的PERV基因序列（GenBank登錄號EF133960.1）和GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到的β-ac?tin序列（GenBank登錄號 AY550069），按照 qPCR引物設計原則，設計PERV-pol基因和內參基因β-actin的引物（表1），以五指山小型豬gDNA為模板進行PCR擴增。50 μL PCR體系包括約100 ng gDNA，10×PCR 緩沖液 5 μL，10 mmol/L dNTPs混合 物 4 μL，上 、下游引 物各 10 pmol，rTaqDNA聚合酶2.5 U，加無菌去離子水至50 μL。PCR擴增程序：94℃變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，循環(huán) 42 次；72℃延伸 5 min，同時設立無模板為NTC。將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接、轉化，得到重組質粒（pMD18-T-PERV-pol，pMD18-T-β-actin），用質粒提取試劑盒提取重組質粒后酶切鑒定，將鑒定為陽性的重組質粒送中美泰和生物技術有限公司進行序列測定。用紫外分光光度計準確測定濃度后，根據(jù)下式計算其拷貝數(shù)，進行1/10梯度稀釋，作為標準品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PERV-pol、β-actin標準曲線的建立 分別以1/10梯度稀釋的標準品質粒pMD18-T-PERV-pol、pMD18-T-β-actin為模板進行 qPCR，采用 20 μL 反應體系，包括 RealMasterMix（SYBR Green）9 μL，模板1 μL，上、下游引物各 6 pmol，加無菌去離子水至20 μL。PCR擴增程序：94℃變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，循 環(huán) 42次；read plates，72℃延伸5 min。用起始模板拷貝數(shù)的10倍對每個稀釋標準品的Cq值做圖，得到PERV-pol及β-actin的標準曲線。

1.5.3 各器官中PERV-pol相對表達量的檢測 分別以4頭豬不同器官的cDNA為模板（濃度5～100 ng/μL，濃度＞100 ng/μL的樣品須稀釋），對PERV-pol、β-actin基因進行qPCR，反應體系及條件同1.5.2，每個樣品設2個復孔，同時設立NTC。采用雙標曲線法，目的基因PERV-pol表達值除以內參基因β-actin表達值為單細胞中PERV-pol的相對表達量，并計算各器官相對于心的表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結果利用Excel軟件和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素多水平假設檢驗，進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗與秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 實時熒光定量PCR檢測PERV的引物

2 結果

2.1 PCR及RT-PCR檢測結果

分別以4頭豬不同器官的gDNA和cDNA為模板，PCR及RT-PCR方法對PERV結構基因gag、pol、env進行檢測，同時設立陽性對照及NTC。所得產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結果表明樣品均擴增出清晰條帶，且片段大小與預期相符。圖1～3為1號豬心、肝、脾、肺、腎、胸腺的gDNA擴增PERV的3種結構基因的電泳圖。

2.2 PERV-pol、β-actin標準曲線的建立

圖1 PCR檢測PERV-gag基因

圖2 PCR檢測PERV-pol基因

圖3 PCR檢測PERV-env基因

分別以 8.25×108～8.25×104拷貝/μL 梯度稀釋的 PERV-pol標準品質粒和 1.62×108～1.62×103拷貝/μL梯度稀釋的β-actin標準品質粒為模板進行qPCR。標準品擴增曲線均呈典型的S形，在反應結束前進入平臺期；標準品熔解曲線為單峰，Tm值分別為 83.2～83.6℃、82.0～82.4℃。PERV-pol標準曲線方程為y=38.77-3.46x，相關系數(shù)r=-0.997（圖4）；β-actin標準曲線方程為y=33.12-3.12x，相關系數(shù)r=-0.998（圖5）。

2.3 各器官中PERV-pol的相對表達量

分別以4頭豬不同器官的cDNA為模板，用qPCR檢測PERV-pol、β-actin基因的表達情況。樣品曲線均在循環(huán)結束前進入平臺期（圖6）。肝、脾、肺、腎、胸腺相對于心的相對表達量分別為72.8%、98.2%、126.4%、81.8%、81.5%（圖7）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，PERV-pol在各器官中的相對表達量不存在顯著差異（P=0.310＞0.05）。

3 討論

PERV是單股正鏈RNA病毒，屬C型反轉錄病毒屬,全長 8.1～8.9 kb。它由 5′非編碼區(qū)、核心蛋白基因（gag）、聚合酶基因（pol）、囊膜基因（env）及3′非編碼區(qū)組成[9]，以前病毒的形式整合在宿主基因組中。PCR及RT-PCR結果表明，五指山小型豬不同器官gDNA和cDNA中均能檢測到PERV的存在與表達，與國外早期報道結果一致[10]。這說明PERV在豬生長發(fā)育早期就已整合在宿主基因組中，并隨宿主基因的復制而復制并表達。

PERV-pol基因可編碼病毒復制所需的反轉錄酶、整合酶、蛋白酶等，是影響病毒復制最重要的結構基因[11]，因此我們對各器官mRNA中pol基因的表達情況進行了相對定量檢測，結果表明不同器官內pol基因的相對表達量不存在顯著性差異。我們的研究結果與國外報道存在一些差異，Clemenceau等[12]通過半定量RT-PCR方法對大白豬不同器官中PERV的3種結構基因進行了檢測，結果均顯示在腎、肝中表達量最高，在胸腺、淋巴結中表達量中等，在胰臟中表達量最低；Bitt?mann等[13]發(fā)現(xiàn)尤克坦小型豬mRNA中PERV-pol基因在脾和肺中表達量最高。這些差異主要與豬的品系、遺傳特征、年齡因素、暴露條件、樣本數(shù)量等有關[14]，其次也可能與檢測方法、引物設計、PCR敏感性不同有關[15]。

圖4 PERV-pol標準曲線

圖5 β-actin標準曲線

圖6 cDNA樣品擴增曲線

圖7 不同器官cDNA中PERV的相對表達量

總之，我們用PCR、RT-PCR及RT-qPCR技術檢測了PERV在五指山小型豬心、肝、脾、肺、腎、胸腺等6種器官中的存在與表達情況。這為異種移植提供了重要的基礎性數(shù)據(jù)，對其病原安全性評價具有重要意義，也有利于我國特有小型豬資源的開發(fā)利用。

[1] Specke V,Rubant S,Denner J.Productive infection of human primary cells and cell lines with porcine en?dogenous retroviruses[J].Virology,2001,285(2):177-180.

[2] Patience C,Takeuchi Y,Weiss R A.Infection man cells by an endogenous retrovirus of pigs[J].Nat Med,1997,3:282-286.

[3] Specke V,Schuurman H J,Plesker R,et al.Virus safety in xenotransplantation:f i rst exploratory in vivo studies in small laboratory animals and non-human primates[J].Transpl Immunol,2002,9(2-4):281-288.

[4] Sypniewski D,Machnik G,Mazurek U,et al.Distribu?tion of porcine endogenous retroviruses(PERVs)DNA in organs of a domestic pig[J].Ann Transplant,2005,10(2):46-51.

[5] Ma Y Y,Yang Y X,Lv M M,et al.Real-time quan?titative PCR with SYBR Green I detection for estimat?ing copy numbers ofporcine endogenousretrovirus from Chinese miniature pigs[J].Transplant Proc,2010,42(5):1949-1952.

[6] Wu J M,Ma Y Y,Lv M M,et al.Large-scale sur?vey of porcine endogenous retrovirus in Chinese minia?ture pigs[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2008,31(4):367-371.

[7] Akiyoshi D E,Denaro M,Zhu H,et al.Identif i cation of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine[J].J Virol,1998,72(5):4503-4507.

[8] Martignat L,Sai P,Jestin A.Detection of porcine en?dogenous retrovirus:possible involvement in pig islet xenotransplantation[J].Diab Metab,1998,24(5):434-441.

[9] 章金剛.豬內源性反轉錄病毒的某些分子生物學特性[J].中國人畜共患病雜志,2003,19(1):116-118.

[10]Yoon J K,Choi J,Lee H J,et al.Distribution of por?cine endogenous retrovirus in different organs of the hybrid of a Landrace and a Jeju domestic pig in Ko?rea[J].Transplant Proc,2015,47(6):2067-2071.

[11]孫宇,馬玉媛,羅佳,等.應用RNA干擾沉默豬內源性反轉錄病毒[J].生物技術通訊,2013,23(1):52-55.

[12]Clemenceau B,Lalain S,Martignat L,et al.Porcine endogenous retroviral mRNAs in pancreas and a pan?el of tissues from specif i c pathogen-free pigs[J].Diabe?tes Metab,1999,25:518-525.

[13]Mazurek U,Kimsa M C,Strzalka-Mrozik B,et al.Quantitative analysis of porcine endogenous retrovirus?es in different organs of transgenic pigs generated for xenotransplantation[J].Curr Microbiol,2013,67(4):505-514.

[14]Zhang P,Yu P,Wang W,et al.An effective method forthequantitativedetection ofporcineendogenous retrovirus in pig tissues[J].In Vitro Cell Dev Biol An?im,2010,46(5):408-410.

[15]Joachim D.How active are porcine endogenous retrovi?ruses(PERVs)[J]?Viruses,2016,8(8):215.