鎘脅迫對豬腎PK-15細胞活性氧和抗氧化酶活性的影響

楊佳，董峰，李向陽，王蘭

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

土壤和水體中的鎘被植物吸收后，導致糧食和飼料被污染[1-4]。飼料添加劑中鎘含量超標，通過攝食和飲水進入動物體，造成動物性食品的污染[5]，不但降低了畜產品的經濟營養價值，而且極大地威脅著我國畜牧業的發展與人類健康[6-7]。

鎘蓄積于生物有機體后，引起腎臟、肝臟、睪丸等多種組織器官的損傷，其中腎臟是鎘的主要靶器官[8]。韓新燕等[9]研究發現，鎘污染的飼料嚴重影響豬的生長性能。鎘可以引起小鼠腎臟水腫，腎小球萎縮、退化，近端腎小管出現空泡化、壞死及炎癥細胞侵潤的現象[10]。鎘與鉛聯合染毒引起綿羊腎小管上皮嚴重變性、壞死，伴隨有亞急性腎小球腎炎[11]。鎘還能引起SD大鼠近端腎小管細胞形態發生顯著性變化，出現細胞皺縮變圓、黏附性降低[12]。但是，鎘引起豬腎臟細胞病變的細胞分子機制目前還不是十分清楚。

鑒于此，我們以豬腎PK-15細胞為研究材料，檢測鎘脅迫引起的PK-15細胞形態變化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成及抗氧化酶活的變化，闡明鎘作用的細胞分子機制，旨在為探討鎘致動物腎臟毒性損傷的機理，以及重金屬對畜牧業養殖的毒性作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腎細胞PK-15購于美國組織培養庫（Amer?ican Tissue Culture Colection，ATCC）。

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）（天津市風船化學試劑科技有限公司）；DMEM高糖培養基（HyClone公司）；0.25%胰蛋白酶（Biosharp公司）；特級胎牛血清（FBS）（生工生物工程有限公司）；噻唑藍（MTT）（Solarbio公司）；二甲基亞砜（DMSO）（登峰化學試劑廠）；Triton X-100（西亞試劑公司）；N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（Sigma公司）；活性氧檢測試劑盒及Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；總超氧化物歧化酶（TSOD）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒、微量還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 細胞培養

PK-15細胞在含5%FBS的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。呈典型上皮細胞的形態，待細胞長滿底壁約90%時，用0.25%胰酶消化收集細胞，并按適當比例接種至新的細胞培養瓶中傳代培養。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

收集對數生長期細胞，按5×103/孔接種于96孔板，置37℃、5%CO2培養箱中培養。設置調零組、對照組和CdCl2處理組，每組4個重復。待細胞長滿底壁約60%時棄去培養液，PBS清洗細胞。對照組加入新鮮培養液，CdCl2處理組加入不同濃度 CdCl2溶液（2、4、6、8 μmol/L），置培養箱中培養24 h。處理結束后，每孔加10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，避光孵育4 h后棄去培養液，每孔加150 μL DMSO溶液，振蕩10 min。用酶標儀檢測各孔的D490nm值，計算細胞存活率［細胞存活率=（測定孔D490nm值－調零孔D490nm值）/（對照孔D490nm值－調零孔D490nm值）×100%］。

1.4 顯鏡觀察細胞形態及細胞內ROS的變化

收集對數生長期細胞，按3.5×104/孔接種于24孔板，每孔500 μL培養液，于37℃、5%CO2培養箱中培養。設置對照組、CdCl2處理組、CdCl2+NAC處理組，每組3個重復。細胞長滿底壁約60%時棄去培養液，PBS清洗細胞。對照組加入新鮮培養液；CdCl2處理組加入不同濃度CdCl2處理細胞 24 h；CdCl2+NAC 處理組用 500 μmol/L NAC提前孵育細胞2 h，之后加入不同濃度CdCl2與NAC共處理細胞24 h。處理結束棄去培養液，PBS清洗細胞，每孔加入250 μL DCFH-DA溶液（用無血清培養液按1∶1000稀釋，終濃度10 μmol/L）于培養箱中避光孵育30 min。孵育結束后，PBS清洗細胞，每孔加500 μL PBS，于光鏡和熒光顯微鏡下觀察。

1.5 用試劑盒測定細胞內抗氧化酶的變化

收集對數生長期細胞，按2×106/皿接種于100 mm細胞培養皿，于37℃、5%CO2培養箱中培養。設置對照組，CdCl2處理組。細胞長滿底壁約50%時棄去培養液，PBS清洗細胞后加不同濃度的CdCl2處理細胞，對照組更換等體積新鮮培養液，于培養箱中培養24 h。處理結束后收集細胞，加入含0.1%Triton X-100的Tris-HCl重懸細胞，置冰上20 min，之后用電動勻漿儀破碎細胞，冰浴，12 000 r/min勻漿4 min。收集細胞勻漿液，用Bradford蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，用相應試劑盒檢測T-SOD、CAT活性和GSH含量。結果均以相對活性/含量來表示T-SOD、CAT活性及GSH含量的變化。

1.6 數據分析

數據采用SPSS 18.0統計軟件進行單因素方差分析，各項實驗至少進行3次獨立重復實驗，結果均以平均值±標準誤（mean±SEM）表示。*P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 CdCl2對PK-15細胞活性的影響

如圖1所示，CdCl2處理PK-15細胞24 h后，隨著CdCl2濃度的增加，細胞活性逐漸下降（P＜0.05，P＜0.01），呈劑量-效應關系 。 2、4、6、8 μmol/L CdCl2濃度下的細胞存活率依次為87.65%、66.49%、48.85%和36.34%。

2.2 CdCl2對PK-15細胞形態和ROS的影響

用不同濃度的CdCl2處理PK-15細胞24 h，對照組細胞呈典型的上皮樣細胞形態。隨著CdCl2濃度的增加，細胞逐漸皺縮，間隙變大，變圓，甚至脫落（圖2A）；用DCFH-DA探針標記細胞內的ROS，熒光顯微鏡觀察，發現熒光強度隨著CdCl2濃度的增加而加強（圖2B）；用抗氧化劑NAC和CdCl2共同處理PK-15細胞24 h，光鏡觀察發現，NAC和CdCl2處理組（圖2C）與CdCl2處理組（圖2A）相比，細胞皺縮程度減弱，變圓，脫落，細胞減少；用DCFH-DA探針標記NAC和CdCl2處理組細胞，細胞內ROS熒光強度較弱，且隨著CdCl2濃度的升高變化不明顯（圖2D）。

圖1 CdCl2對PK-15細胞活性的影響（n=4）

2.3 CdCl2對PK-15細胞內抗氧化系統的影響

CdCl2處理PK-15細胞24 h，檢測PK-15細胞內抗氧化物酶SOD和CAT的活性及GSH的含量變化。結果表明（圖3A），與對照組相比，SOD活性隨著CdCl2濃度增加呈上升趨勢，且濃度為8 μmol/L時T-SOD活性最高且差異顯著（P＜0.05）；如圖3B所示，不同濃度CdCl2處理下，PK-15細胞內的CAT活性均低于對照組，且差異極顯著（P＜0.01）；觀察圖 3C 發現，2 μmol/L CdCl2處理的細胞，GSH 的表達增加，當 CdCl2濃度達 6、8 μmol/L時，細胞內GSH含量顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

鎘能通過抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞或誘導組織或細胞發生氧化應激，產生大量的ROS，ROS主要包括超氧陰離子自由基（·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH·）[13]。本研究結果表明，PK-15細胞在不同濃度CdCl2作用下，細胞活性顯著降低；用特異性熒光探針DCFH-DA標記發現，細胞內ROS熒光強度隨著CdCl2濃度增加而加強，細胞逐漸皺縮、變圓、脫落。NAC是一種含有巰基的活性氧清除劑，與CdCl2共處理細胞發現，細胞內ROS熒光強度比Cd單獨處理組顯著下降，細胞皺縮、變圓程度明顯降低，說明CdCl2脅迫下PK-15細胞的形態病變與ROS生成有關。周筱軒等[14]用CdCl2與NAC共處理人乳腺癌MCF-7細胞6 h后使ROS熒光強度明顯降低；汪紀倉等[15]也用NAC與醋酸鎘（CdAc2）共處理肝細胞24 h后發現明顯減少了鎘所致細胞皺縮及壞死現象。以上研究報道與本實驗結果相似，表明鎘脅迫PK-15細胞發生氧化應激介導的細胞損傷。

圖2 CdCl2處理（A、B）、NAC和CdCl2共處理（C、D）對PK-15細胞形態（A、C）和ROS（B、D）的影響

圖3 CdCl2對PK-15細胞內T-SOD（A）、CAT（B）、GSH（C）的影響（n=3）

細胞內存在天然的抗氧化系統，是細胞抵抗外源物脅迫的第一道防線。GSH是一種含巰基的蛋白，作為細胞內重要的抗氧化劑，能有效清除自由基。抗氧化酶主要是T-SOD和CAT，TSOD能特異性歧化·為 H2O2和 O2，產物 H2O2也具有強氧化性，能被CAT催化為H2O。抗氧化系統成分之間存在緊密的相互作用[16-17]，過量的ROS使得細胞內抗氧化系統失衡，抗氧化系統的消耗又會增加細胞內的ROS。本實驗結果表明，隨著CdCl2濃度增加，細胞內ROS含量逐漸增加，并且T-SOD活性隨CdCl2濃度升高呈上升趨勢，CdCl2達 8 μmol/L 時，T-SOD 活性著性增加。TSOD活性升高，一方面可能是CdCl2誘導T-SOD基因表達，另一面·增多也會導致T-SOD表達增加[18]。汪紀倉等[15]用 2.5、5、10 μmol/L 的 CdAc2處理大鼠肝細胞24 h后，SOD活性顯著增加。也有研究表明，CdCl2處理組織或細胞引起SOD活性降低[19]，這可能與藥物種類、處理時間、藥物濃度和細胞種類等因素相關。本研究結果顯示，不同濃度CdCl2處理下的PK-15細胞內CAT活性顯著低于對照組，推測是鎘脅迫下，PK-15細胞內ROS的增多誘導T-SOD活性增加，T-SOD分解·形成的產物H2O2也增多，清除增多的H2O2需要消耗大量CAT，使得CAT活性極顯著下降[20]；也可能是合成CAT的速度低于清除H2O2消耗的速度，導致CAT酶活極顯著下降[21]。還有可能，CAT是以鐵卟啉為輔基的結合酶，其中Fe3+是分解H2O2的主要位點，而游離的Cd2+可能與Fe3+發生替換，導致CAT構象改變并失活，而游離態的Fe3+也會觸發Fenton反應，產生更多的自由基，導致CAT活性降低[22]。Jurczuk等[23]研究表明，給鼠喂食50 mg/L的含CdCl2水能引起鼠腎臟組織SOD活性升高，CAT活性下降。本實驗中CAT活性在8 μmol/L CdCl2作用下稍有升高，同濃度下T-SOD活性及GSH含量顯著增加，可能是細胞應對鎘產生了耐受性。圖3C表明，低濃度下細胞內GSH含量增加，這可能是細胞的一種應激反應，GSH可以分解H2O2為H2O，GSH含量顯著增加可能是隨著ROS的增加和SOD活性增加產生的H2O2逐漸增多誘導了GSH的表達。同時，CAT活性下降，增加GSH的含量用于抵抗鎘毒性。Gaubin等[24]研究表明，低濃度CdCl2（0、1、5、10 μmol/L）作用人肺腺癌細胞A549引起細胞內GSH顯著增加，但高濃度CdCl2（25、50、75、100 μmol/L）作用下 GSH 顯著性降低，低濃度下的GSH增加是細胞抵抗鎘毒性的一種自我保護結果，與本實驗中結果相似。Nzengue等[25]用 15、50、100 μmol/L CdCl2處理 HaCaT 細胞24、48 h，發現GSH含量極顯著增加。

此外，鎘誘導組織或細胞產生大量ROS也可能直接造成DNA、蛋白質等生物大分子的氧化損傷，產生功能障礙。DNA損傷會造成基因組不穩定，繼而引起細胞周期阻滯等生物學現象[26-28]。過量的ROS還會引起細胞內線粒體膜損傷，降低線粒體膜電位，改變其通透性，最終導致細胞凋亡的發生[29-30]。CdCl2脅迫對PK-15細胞DNA、細胞周期和細胞凋亡的影響有待進一步研究。

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