利用酵母雙雜交技術篩選人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

周曉濤，周文濤，夏開德，劉化蝶，彭震，趙云娟，迪麗娜爾·波拉提，李家大

1.新疆醫科大學 基礎醫學院免疫學教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學 第五附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830011；3.貴州省婦幼保健醫院，貴州 貴陽 550000；4.中南大學 醫學遺傳學國家重點實驗室，湖南 長沙 410000

人前動力蛋白受體2（human prokineticin re?ceptor 2，hPROKR2）由384個氨基酸殘基構成，其基因位于人類第20號染色體（20p12.3），mRNA全長2242 bp。hPROKR2屬于G蛋白偶聯受體，當其與配體前動力蛋白（prokineticin，PK）結合后，可參與血管發生、平滑肌收縮及促胚胎期神經元發育和遷移[1-3]?；蛐脱芯堪l現hPROKR2和PK2的突變與Kallmann綜合征和/或特發性（單純性）促性腺激素型性腺功能減退的發病有關，主要表現為青春期延遲和不孕[4-6]。對hPROKR2分子功能的研究已有很多，但多集中在其胞內區Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ環功能方面[7-9]，而針對其胞內區C端的功能研究仍是空白[10]。我們欲以酵母雙雜交技術作為實驗平臺，將hPROKR2胞內區C端（333～384 aa）由52個氨基酸殘基組成的蛋白作為誘餌（圖1），在人cDNA文庫中尋找能與hPROKR2 C端相互作用的蛋白，以豐富G蛋白偶聯受體（G proteincoupled receptor，GPCR）相互作用蛋白（GPCR in?teracting proteins，GIPs）的信息，并進一步研究hPROKR2的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母Y2HGold（MATa表型），凍存菌種Y2HGold-hPROKR2-Ct（Ct，C 端），人 cDNA 文庫，酵母培養基和營養缺陷型培養基SDO（SD/-Trp，SD/-Leu）、DDO（SD/-Leu/-Trp）、QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp），金 擔 子 素 A（aureobasidin A，AbA），X-α-Gal購自Clontech公司；感受態大腸桿菌DH5α、質粒pcDNA3.1-HA-SNAPIN、pGEX-3X-hPROKR2 Ct為中南大學醫學遺傳學國家重點實驗室保存；E.Z.NA plasmid Mini試劑盒購自Ome?ga公司；溶壁酶、二甲亞砜（DMSO）等試劑購自Sigma公司。

圖1 hPROKR2蛋白C端模式圖

1.2 酵母雙雜交及文庫篩選

1.2.1 雜交 用無菌槍頭挑取凍存菌種Y2HGoldhPROKR2-Ct在SD/-Trp瓊脂板上劃線，30℃培養至單克隆長出后，挑取1個單克?。ㄖ睆? mm）置于50 mL SD/-Trp液體培養基（含50 μg/mL卡那霉素）中，于30℃、250 r/min振蕩培養30～40 h，至D600nm值為0.8時收集菌液，1000 r/min離心5 min，棄上清，再加入4 mL SD/-Trp液體培養基混懸。取文庫1 mL、SD/-Trp菌液1 mL、2×YPDA液體培養基45 mL加入2 L無菌錐形瓶中，于30℃、50 r/min培養24 h，期間取10 μL培養物用生理鹽水稀釋至1/10，用相差倒置顯微鏡觀察，當出現三聚體形態時，將菌液1000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5×YPDA液體培養基（含50 μg/mL卡那霉素）10 mL混懸，測量總體積，取其中10 μL雜交液做融合效率測定，其余以200 μL涂布于QDO板（直徑150 mm）上，30℃培養3～5 d。

1.2.2 融合效率測定 將10 μL雜交混懸液用0.9%NaCl溶液分別稀釋至 1/1000、1/10 000，各取 100 μL涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp平板（直徑100 mm），30℃培養3～5 d。融合效率計算公式：克隆融合效率=DDO皿上長出的克隆數×重懸雜交液量（mL）×10×稀釋度。

1.3 相互作用陽性克隆的篩選及測序

用無菌槍頭挑1個上述QDO平板上的克隆，在QDO/A/X平板上劃線，30℃培養3～5 d，此時可以看到平板上出現藍、白克隆分離現象；挑取其中的藍色克隆，繼續在QDO/A/X平板上劃線，直至所有克隆均為藍色；用無菌槍頭挑取1個藍色克隆置于2 mL QDO液體培養基中，30℃、250 r/min培養約48 h，取 500 μL菌液于-80℃凍存保種，余1.5 mL菌液以14 000 r/min、4℃離心5 min后棄上清，加入1×TE緩沖液100 μL、溶壁酶（15 U）20 μL混勻，37℃、280 r/min孵育 1 h，再加入20%SDS 200 μL，室溫放置 10 min后高速離心10 min，棄上清；用E.Z.NA plasmid Mini試劑盒提取質粒，最終溶解在30 μL TE溶液中；取15 μL質粒轉化感受態大腸桿菌DH10B，用含氨芐西林的LB平板篩選；取1個克隆，擴增后測序（pGADT7.A，T7引物正向測序）；根據文庫所用質粒pGADT7-RecAB的序列及篩選到的質粒的測序結果，通過NCBI進行Blast比對，確定篩選出的蛋白序列，分析判斷選取有意義的蛋白進行后續確證。

1.4 篩選到人cDNA文庫質粒的自活性驗證

1.4.1 制備酵母菌種Y2HGold感受態 無菌挑取凍存的酵母菌種Y2HGold在YPDA板上劃線，30℃倒置培養3～5 d；挑1個單克?。ㄖ睆郊s2 mm）至3 mL 1×YPDA液體培養基中，30℃、250 r/min培養 12 h；取 1 μL 產物加入 5 mL 1×YPDA液體培養基中，于30℃、250 r/min培養過夜；離心（700 r/min，5 min）棄上清后加入20 mL 1×YPDA液體培養基重懸菌液，30℃、250 r/min培養3～5 h，至D600nm為0.4～0.5；離心（700 r/min，5 min）棄上清后加入6 mL無菌ddH2O重懸，離心棄上清后再加入300 μL 1.1×TE/LiAc重懸沉淀；瞬時高速離心后棄上清，加入 120 μL 1.1×TE/LiAc重懸菌液，置冰上待用。

1.4.2 將PGBKT7-hPROKR2-Ct質粒與篩選到的人cDNA文庫質粒共轉入酵母感受態 在2個預冷的EP管中同時加入50 μL感受態細胞、50 μg Yeastmaker Carrier DNA及100 ng篩選出的人cDNA文庫質粒，再將100ngPGBKT7-hPROKR2-C端質粒或100 ng PGBKT7空質粒分別加入體系，加入500 μL PEG/LiAc溫和混勻，30℃孵育30 min，加入20 μL DMSO混勻，42℃水浴15 min，高速離心后棄上清，加入500 μL YPD plus培養基重懸，30℃、250 r/min孵育60 min，高速離心棄上清后加入500 μL 0.9%NaCl溶液重懸，取100 μL涂布于DDO平板（直徑100 mm）上，30℃倒置培養3～5 d，無菌挑取1個白色克隆分別在DDO/X、QDO/A/X平皿上劃線，結果判定如表1。

1.5 GST pull down驗證hPROKR2蛋白C端與SNAPIN的相互作用

將質粒pGEX-3X-hPROKR2 Ct（實驗室儲備）及pGEX-3X通過熱激鈣轉法轉入感受態大腸桿菌DH5α，IPTG誘導分別表達GST-hPROKR2 C端融合蛋白及GST蛋白，并經Western印跡鑒定。在鑒定無誤的菌泥中加入PBS裂解緩沖液（含蛋白酶裂解液），超聲波破碎后離心收集上清至新EP管，為細菌裂解液。每份細菌裂解液中均加入30 μL GST磁珠，4℃翻轉 3 h后用 1 mL冰 PBS洗滌 4次（800 r/min離心 1 min），將 pcDNA3.1-HA-SNAPIN轉染293T細胞，用1 mL GST pull down緩沖液（含蛋白酶裂解液）裂解并轉至EP管中，4℃翻轉90 min，離心后取上清至新EP管待用，此為細胞裂解液。取15 μL細胞裂解液作為Input。

在一份GST蛋白結合的GST磁珠中加入300 μL細胞裂解液，用GST pull down緩沖液（含蛋白酶裂解液）補足至1 mL，4℃翻轉過夜，離心棄上清，用1 mL冰GST pull down緩沖液洗滌6次（800 r/min離心1 min），高速瞬時離心，盡可能吸盡上清，加入 30 μL 2×SDS上樣緩沖液，95℃變性10 min，Western印跡檢測HA-SNAPIN的存在。

2 結果

2.1 酵母雙雜交及文庫的篩選

2株酵母菌株的雜交液以30℃、50 r/min低速振蕩培養24 h后，在相差倒置顯微鏡（×40）下可以看到“三葉草”樣酵母占視野95%以上，說明雜交成功。本次實驗共收獲雜交液12.5 mL，每次取200 μL雜交液涂QDO板，共涂59塊。圖2中DDO板上顯示100 μL稀釋至1/10 000的雜交液經培養后長出110個克隆克隆，據此計算雜交融合效率為 110×12.5×10×10 000=1.375×108。

表1 酵母雙雜交中真陽性與假陽性的判定

2.2 相互作用陽性克隆的篩選

12.5 mL雜交液共涂布于60塊QDO培養皿上，30℃培養72 h后可見獨立酵母克隆出現（圖3A），用無菌槍頭挑克隆在新的QDO/X板上劃線，會出現藍、白克隆分離現象（圖3B），每次挑藍色克隆再在新的QDO/X上劃線，直至不再出現白色克隆為止（圖3C）。挑取最后分離出來的藍色克隆進行菌種凍存，并提取酵母質粒送華大公司測序。本次實驗共挑選150個克隆測序，根據文庫所用質粒pGADT7-RecAB的序列及測序結果與NCBI比對，共篩選到8個有意義的蛋白序列，進一步通過文獻搜索對蛋白功能進行查詢，綜合考慮后認為其中6個蛋白具有研究意義，其中一個為人SNAPIN（NP_036569.1）的44～136位氨基酸序列。

2.3 篩選到人cDNA文庫質粒的自活性驗證

從圖4A中DDO/X平板可看出，當人cDNA文庫中的3、23號克隆與pGBKT7-hPROKR2-Ct共轉入酵母菌Y2HGold時可使底物X-α-gal發生顏色改變，而兩者與pGBKT7共轉入酵母菌Y2HGold時不能使底物X-α-gal發生顏色的改變；1號克隆與pGBKT7-hPROKR2-C端或pGBKT7共轉入酵母菌Y2HGold時，兩者都可使底物X-α-gal發生顏色改變。從圖4B中QDO/A/X平板可看出，3、23號克隆與pGBKT7-hPROKR2-Ct共轉入酵母菌Y2HGold時可使底物X-α-gal發生顏色改變，抵抗金擔子素A毒性長出藍色克隆，而當兩者與pGBKT7質粒共轉入酵母菌Y2HGold時無克隆長出；1號克隆與pGBKT7-hPROKR2-C端或pGBKT7共轉入酵母菌Y2HGold時都使底物X-α-gal發生顏色改變，且抵抗金擔子素A毒性長出藍色克隆。以上說明3、23號克隆為可能的相互作用蛋白，1號克隆為假陽性。

圖2 雜交融合效率測定

圖3 雜交液涂板與劃線

2.4 GST pulll down實驗驗證hPROKR2蛋白C端與SNAPIN的相互作用

從圖5可看出，原核表達的hPROKR2蛋白C端可與SNAPIN相互作用。

圖4 篩選出克隆的自活性驗證

圖5 GST pull down實驗檢測hPROKR2蛋白與SNAPIN之間的相互作用

3 討論

GIPs可以與GPCR的細胞內環、跨膜區及C端結合，有著很多重要的功能，如將GPCR靶向運輸到特異的亞細胞器、參與GPCR與下游效應分子的相互作用、協助GPCR變構從而發揮受體功能等。hPROKR2是GPCR家族中的一員，其結構包括7個跨膜螺旋（TM）、3個細胞內環（IL1～3）及胞內C端。hPROKR2與相應配體PK結合后可激活Gq/11，導致胞漿內磷酸肌醇增加，產生鈣流[11]；也可通過激活Gi/o降低胞內cAMP的濃度[12]，激活Go通過使絲裂原活化蛋白激酶磷酸化從而傳遞信號[11]，參與人體的各種生理過程，包括血管生成、胃腸道蠕動、晝夜節律、情緒和痛覺[1,2,13-15]。目前研究多集中在hPROKR2的結構與功能方面，在其相互作用蛋白及信號通路激活等方面的研究較少。GPCR的胞內區C端在GPCR的細胞生物學功能中具有重大意義，因此尋找與hPROKR2胞內區C端相互作用的GIPs，對于進一步理解hPROKR2的功能尤為重要。

酵母雙雜交系統被廣泛用于研究已知蛋白間的相互作用、尋找2個互作蛋白間起關鍵作用的結構域、尋找靶蛋白的互作新蛋白等方面。酵母轉錄激活因子GAL4的N端有一個由147個氨基酸殘基組成的DNA結合域（DNA binding do?main，BD），C端有一個由113個氨基酸殘基組成的轉錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD和AD在功能上是相互獨立的，其中BD可與上游的激活序列（upstream activating se?quence，UAS）結合，AD可激活UAS下游的基因進行轉錄，但僅當兩者在一起時GAL4才具有完整的轉錄激活因子功能。酵母雙雜交技術就是建立在這個原理之上的：當作為誘餌的已知蛋白——BD融合蛋白、文庫中隨機序列——AD融合蛋白在酵母內正常表達，并且兩者能相互結合時，GAL4分子的BD與AD結合在一起，具有完整的轉錄激活因子功能，從而激活UAS下游基因進行轉錄。在選擇性培養基上，符合條件的克隆就能抵抗氨基酸營養缺失生長出來，并發生相應的顏色改變。在本實驗中，我們用hPROKR2蛋白C端（333～384 aa）作為誘餌，在人 cDNA 文庫隨機表達片段中尋找其互作蛋白。雜交步驟完成后，我們盡可能將所有的雜交液涂板。按照隨機組合的原則，72 h后DDO平皿上長出來的酵母克隆中有可能含有hPROKR2蛋白C端和多個來自人cDNA文庫的隨機片段，當然其中有一個為互作文庫片段，在DDO平皿上劃線時就會出現“克隆分離”現象，具體表現為劃線過程中會出現藍、白克隆分離。因此，實驗中需要在DDO平皿上反復劃線，直到出現的克隆全部為藍色，說明在此藍色克隆里僅存在與hPROKR2蛋白C端及與其相互作用的人cDNA文庫片段蛋白。由于酵母為真核生物，有自己的基因組序列，故一般存在于酵母中的質粒很少，從酵母中提取質粒后，須進一步轉化細菌感受態進行擴增并測序。特別須提出的是，在酵母雙雜交中，誘餌基因是構建在質粒pGBKT7（卡那霉素抗性）上的，而人cDNA文庫片段是在pGADT7-RecAB質粒（氨芐西林抗性）上的，從酵母中提取質粒后采用含氨芐西林的培養基進行選擇培養時，則僅有與hPROKR2蛋白C端互作的人cDNA片段才會被擴增出來。

在酵母雙雜交實驗中，還有一些問題需要注意：①為了保證雜交實驗的質量，一般要對雜交效率進行驗證，本實驗中雜交融合效率為1.375×108；②選擇合適的雜交時間：在倒置顯微鏡下看到“三葉草”結構占80%～90%視野時，往往提示雜交較為成功；③雜交液的涂板：為了提高文庫的使用效率，盡可能將所有雜交液全部涂于平板，且要盡可能涂布均勻，否則酵母的生長會受到阻礙，不易出現克隆。本實驗中，我們在人cDNA文庫中共篩選出331個克隆，經過后期反復劃線驗證，最終150個克隆被送測序，將測序結果上傳NCBI進行序列比對，發現有意義蛋白的cDNA區有8個，多集中在前80個克隆中，其中有些序列反復多次出現，而這些序列就顯得更為重要。通過NCBI在線Blast分析結果，再結合Unipro（http://www.uniprot.org/）在線蛋白質功能分析及對hPROKR2功能的考慮，認為有意義的克隆序列為5個，其中一個為SNAPIN。

鑒于酵母雙雜交結果的假陽性較多，對從cDNA文庫篩選得到的結果，一般還需用多種方法進一步驗證。GST pull down實驗常被用于體外驗證2個蛋白間是否存在相互作用。我們首先在細菌中表達GST-hPROKR2蛋白C端，提取后將其掛在GST珠子上，再與真核細胞內表達的HASNAPIN蛋白體外結合，通過Werstern印跡檢測HA-SNAPIN蛋白的有無，以判斷兩者之間是否存在互作關系。我們的實驗結果顯示hPROKR2蛋白C端與SNAPIN之間存在相互作用。綜上，SNAPIN為hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白，其對hPROKR2的功能調控還有待進一步研究。

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