靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的DNA適配體篩選

翟景勤 ，竇曉倩 ，王文宇 ，付潔 ，王宇光 ，宋海峰 1，

1.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京100850；3.軍事科學院 軍事醫學研究院 生命組學醫學研究所，北京 100850

適配體（aptamers）通過空間結構與靶分子特異性識別，主要采用指數富集配基系統進化（sys?tematic evolution of ligands by exponential enrich?ment，SELEX）技術[1-2]從單鏈寡核苷酸（ssDNA）文庫中篩選獲得。近年來有關適配體篩選方法的不斷更新與應用，使得快速篩選獲得目標適配體成為可能，加速了其在基礎研究、臨床治療和診斷方面的轉化應用[3-7]。適配體的功能類似于抗體，但又有其獨特優點，如靶分子范圍廣、性質穩定，易于制備且制備周期短等[8-11]。此外，作為“抗體類似藥”[9,12]，適配體逐漸被應用于靶向治療藥物的研究。與靶分子結合發揮生物活性的適配體可單獨成藥用于臨床，除了適配體藥物Macu?gen（哌加他尼那）已應用于治療年齡相關性黃斑變性[13]外，目前還有幾十種藥物處于臨床試驗階段。適配體除了以單藥的形式應用外，還可以雙適配體藥物形式、適配體化療藥物偶聯物的靶向化療藥物等形式，在腫瘤治療中發揮重要作用。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1（glypican-1，GPC1）是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteogly?cans，HSPGs）家族的一員,近年研究表明，其主要與乳腺癌、胰腺癌的發生發展密切相關。Matsuda等[17-18]的發現GPC1在乳腺癌中高表達，并且與多種肝素結合生長因子的促有絲分裂有關。此外，GPC1在慢性胰腺炎組織和正常胰腺組織中低表達，而在胰腺癌細胞以及鄰近的成纖維細胞中高表達。胰腺癌異植瘤裸鼠模型中，抑制GPC1的表達可以顯著抑制腫瘤生長、血管生成能力以及轉移能力[19-21]。另外，研究發現[22]胰腺癌患者體液中含有GPC1，富集在胰腺癌衍生的外泌體（GPC1+crExos）上，由于 GPC1+crExos的檢測具有顯著的特異性和靈敏性，所以可依據體液中GPC1+crExos水平的高低將慢性胰腺炎患者和早期與晚期的胰腺癌患者區分開來，同樣在乳腺癌患者中也可觀察到體液中GPC1+crExos的升高,因此GPC-1可作為新的腫瘤標記物，有利于早期腫瘤的發現。我們以GPC1為靶點，從ssDNA文庫中篩選DNA適配體，為以GPC1適配體為基礎的診斷和靶向治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細胞（ATCC細胞庫）；Panc-1細胞系、乳腺癌ZR-75-1細胞系（北京協和細胞庫）。設計并構建全長81 nt隨機ssDNA文庫及相應引物（ssDNA 文庫：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCT CAA-38n-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′；文庫上游引物primer1：5′-GGGAGCTCAGAATAAACG CTCAA-3′；文庫下游引物 primer2：5′-GCTCAGA ATAAACGCTCAA-3′；文庫下游引物 primer3：5′-Biotin-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3′。 文 庫 及引物均由上海生工生物公司合成）。

熒光定量試劑盒（天根生化公司）；重組人GPC1蛋白（云克隆公司）；慢病毒包裝載體pLP1、pLP2、VSV-G（Invitrogen公司）；pMD-GPC1質粒（北京義翹神州公司）；pCDH-CMV-MCS-EF1-Pu?ro質粒（System Biosciences公司）；pGL4.50［luc2/CMV/Hygro］質粒、螢光素酶檢測試劑盒（Promega公司）；轉染試劑MegaTran 1.0（OriGene公司）；TMB底物顯色試劑盒（康為世紀公司）；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、無胰酶消化液（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；兔抗人GPC1、抗體羊抗兔IgG（Abcam公司）；TaqDNA聚合酶（博邁德生物技術公司）；短片段膠回收試劑盒（百泰克生物公司）；磁力架、鎳離子螯合磁珠、鏈霉親和-生物素磁珠（海貍生物醫學工程公司）；蛋白磁珠結合緩沖液（20 mmol/L Na3PO4，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH7.4）；咪唑洗脫 液（20 mmol/L Na3PO4，50 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH7.4）；鏈霉親和素-生物素磁珠緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，0.01%～0.1%Tween-20，pH7.4）；磷酸鹽緩沖液（PBST，50 mmol/L K2HPO4，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween-20，pH7.5）。

LightCycler 96實時熒光定量PCR儀（Roche公司）；HulaMixer樣品混合器（Life公司）；離心機、CO2培養箱（Thermo公司）；凝膠圖像分析系統（上海天能科技公司）；超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化工程公司）；生物安全柜（北京東聯哈爾公司）；細胞自動計數儀（Count Star公司）；DSY5000X熒光顯微鏡（重慶澳浦光電公司）；流式細胞儀（BD公司）。

1.2 Luc-ZR-75-1GPC1穩定細胞系的構建

將pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro載體雙酶切獲得線性化pCDH載體，分別以pGL4.50和pMDGPC1質粒為模板，擴增螢光素酶基因片段和GPC1基因片段，并將片段與線性化pCDH載體進行酶連，獲得重組質粒pCDH-EF1-GPC1-CMVLuc2-T2A-Pur（pEGCL），即人GPC1蛋白和螢光素酶共表達質粒。用MegaTran 1.0轉染試劑將該重組質粒與質粒pLP1、pLP2、VSV-G按說明書混合后轉染HEK 293T細胞進行慢病毒包裝，12 h后換液用含2%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基繼續培養60 h，收集含有慢病毒的細胞上清，并以1∶1的比例與含10%FBS的RPMI 1640培養基混合培養ZR-75-1細胞，48 h后用含嘌呤霉素與10%FBS的RPMI 1640培養基進行壓力篩選。

1.3 Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1細胞系表達鑒定

1.3.1 GPC1表達鑒定 將培養的Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1細胞分別用細胞消化液消化至單細胞懸液，計數后按每管 1×106分裝，用 100 μL PBS重懸，加入兔抗人GPC1抗體孵育1 h，PBS洗2次，100 μL PBS重懸后加入羊抗兔IgG孵育30 min，PBS洗2次，400 μL PBS重懸后進行流式細胞檢測。

1.3.2 Luc-ZR-75-1GPC1細胞熒光素酶表達鑒定ZR-75-1、ZR-75-1pCDH-GFP、Luc-ZR-75-1GPC1細胞分別以100 μL（5×104/孔）接種至 96孔板，在 CO2細胞培養箱中培養12 h，將螢光素酶檢測試劑盒中的凍干粉底物與緩沖液混合，100 μL/孔加入96孔板中，反應5 min，于酶標儀中檢測熒光。

1.4 SELEX篩選

1.4.1 磁珠蛋白制備 用1.25 mL結合緩沖液重懸150 μL鎳離子螯合磁珠，加入GPC1蛋白（或反篩蛋白Her3-ECD）20 μg，4℃旋轉結合1 h，用PBST洗滌磁珠3次，加入200 μL PBST保存于4℃，蛋白終濃度為0.25 μg/μL。

1.4.2 GPC1蛋白篩選 將1 nmol ssDNA溶于100 μL PBST中，95℃熱解變性 5 min后立即置于冰上冷卻5 min，取GPC1蛋白磁珠（每輪篩選蛋白濃度見表1）與文庫于10 mL PBST（含1 μg/mL牛血清白蛋白）中室溫旋轉結合30 min，置磁力架上分離，用500 μL PBST洗滌蛋白磁珠3次，加入15 μL洗脫液，取適量洗脫液作為模板進行qPCR擴增。

1.4.3 Her3-ECD蛋白反篩 ssDNA與反篩蛋白Her3-ECD在1 mL PBST中室溫旋轉孵育30 min，置磁力架上磁性分離，收集結合液，用酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，無水乙醇沉降ssDNA后溶于20 μL無菌水，作為模板進行qPCR擴增。

1.4.4 qPCR擴增 反應體系20 μL包括熒光定量混合液10 μL、引物（primer1+primer3，10 nmol/L）0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8.5 μL。反應條件為 95℃預變性 900 s，然后以 95℃變性 10 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s行15～25個循環，融解曲線分析后37℃持續30 s。

1.4.5 ssDNA文庫制備 經擴增有生物素標記的dsDNA在鏈霉親和素-生物素磁珠緩沖液中與鏈霉親和素-生物素磁珠室溫旋轉結合1 h，用500 μL鏈霉親和素-生物素磁珠緩沖液洗滌磁珠3次，用50 μL NaOH溶液與磁珠于37℃孵育15 min使dsDNA變性解鏈，收集含ssDNA的NaOH溶液，加入1 mL PBST后用10 mmol/mL磷酸二氫緩沖液調節pH值為7.5后保存，或直接投入下一輪篩選。進行4輪共10次篩選，包括2輪反篩，且ssDNA文庫與蛋白磁珠的孵育時間、擴增的反應循環數隨篩選的進行逐漸減少，而清洗蛋白磁珠的時間相對延長。

1.5 克隆與測序

將最后一輪篩選得到的適配體文庫用引物primer1+primer2和TaqDNA聚合酶擴增，擴增產物回收純化后與T4載體酶連并進行轉化，挑選克隆，菌液PCR鑒定，挑選陽性克隆測序。用DNA?MAN軟件分析適配體的二級結構。

表1 SELEX篩選蛋白濃度流程表

1.6 適配體ELISA親和力鑒定

將GPC1蛋白用包被緩沖液進行濃度梯度稀釋，100 μL包被于酶標板中4℃過夜；棄去孔內液體，用 300 μL PBST 洗板 5次，加入 100 μL 含1%BSA 的 PBST封閉 3 h；300 μL PBST洗板 5次，加入100 μL PBST稀釋的5′端生物素標記的適配體室溫結合1 h；300 μL PBST洗板5次，加入100 μL PBST稀釋的二抗SA-HRP室溫孵育30 min；300 μL PBST洗板5次，用TMB底物顯色試劑盒室溫顯色25～30 min；加入2 mol/L H2SO450 μL后于酶標儀上測定D450nm值；選擇軟件Ori?gin 75，根據濃度梯度與吸光度值擬合親和力曲線，記錄親和力常數Kd，并分析適配體的親和力。

1.7 流式鑒定適配體特異性

同上流式細胞處理步驟進行Panc-1、Luc-ZR-75-1GPC1和HEK293T流式細胞的準備，將200 pmol的5′端FITC標記的適配體分別加入細胞懸液中孵育1 h，清洗重懸后進行流式細胞檢測。

1.8 統計學分析

采用Excel的Student-t-test軟件進行統計學分析，實驗數據以x±s表示，2組間比較采用學生t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，所有試驗均重復3次。

2 結果

2.1 pEGCL重組質粒鑒定

對pEGCL重組質粒用限制性內切酶雙酶切（圖1A）鑒定和測序比對（數據未示），表明CMVLuc2和GPC1基因以雙啟動子（EF1和CMV）串聯形式構建入pCDH-EF1-GPC1-CMV-Luc2。基于流式細胞術對Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1細胞系表面GPC1表達鑒定見圖1B，Panc-1和穩轉Luc-ZR-75-1GPC1細胞系GPC1抗原陽性率分別為77.7%和86.14%，而陰性對照293T組的GPC1抗原表達低（2.77%），說明Panc-1和穩轉Luc-ZR-75-1GPC1細胞系表面均表達GPC1抗原，可用于后續實驗。熒光素酶基因報告實驗中，穩轉pEGCL質粒的Luc-ZR-75-1GPC1細胞在裂解后加入底物熒光素檢測到生物熒光，熒光值為1 224 872 RLU，而不含螢光素酶基因的ZR-75-1細胞和轉染pCDH-GFP的ZR-75-1細胞（ZR-75-1pCDH-GFP）的熒光值分別為1751和2021 RLU，遠遠低于Luc-ZR-75-1GPC1細胞的熒光值（P＜0.001），表明穩定轉染的Luc-ZR-75-1GPC1細胞系同時有效表達螢光素酶，為后續體內活體GPC1 ssDNA適配體靶向成像研究奠定了基礎。

2.2 適配體二級結構預測

經過10輪篩選，挑出24個陽性克隆進行測序，長度81 bp的有效ssDNA序列為23條。運用DNAMAN軟件對適配體進行二級結構分析，適配體可分為5類，第1類（#1、#4、#5、#7、#8、#10）適配體的二級結構特征為富含內環的雙鏈（圖2A）；第 2類（#2、#3、#11、#16、#22）適配體是以小環為中心外連若干莖環（圖2B）；第3類（#6、#12、#13、#14、#15、#17、#20、#24）適配體結構特征為不穩定大環兩端為莖環（圖2C）；第4類（#9、#21）適配體5′和3′端近端附近均形成莖環，隨機序列區為富含內環的雙鏈（圖2D）；第5類（#18、#19）適配體隨機序列部分與5′端及3′端形成多個內環并依據力的作用相互靠近（圖2E）。

2.3 適配體與GPC1的親和性與特異性鑒定

圖1 pEGCL重組質粒構建和表達鑒定

從上述5類適配體中各選出1條（#6、#11、#9、#10、#18）進行FITC標記和生物素標記合成，通過ELISA分析，根據蛋白濃度進行親和力曲線模擬，親和力較好的為#9適配體（圖3A，#9適配體的Kd=44±0.69 nmol/L），#6、#11、#10、#18適配體解離常數均為100～160 nmol/L。圖3B為#9適配體與陽性組GPC1蛋白和陰性對照組Her3-ECD、空白對照及牛血清白蛋白（BSA）的結合D值，陽性對照組與陰性對照組相比具有顯著性差異，說明篩選的適配體在GPC1蛋白水平上具有較高的親和力。通過流式細胞術驗證適配體對Panc-1、Luc-ZR-75-1GPC1細胞系結合的特異性，結果以#9適配體與2種細胞的親和力最強，陽性率分別為44.69%和51.44%（圖3C），其他幾條適配體與2種細胞系的陽性率均為20%-40%，適配體與GPC1陰性細胞系ZR-75-1和HEK 293T的結合率為5%以下。說明篩選出的GPC1適配體與Panc-1、Luc-ZR-75-1GPC1細胞系具有良好的特異性。

3 討論

GPC1在胰腺癌及乳腺癌中高表達，可作為腫瘤的生物標志物，在早期癌癥診斷中發揮重要的作用[22]，因此，我們篩選靶向GPC1的適配體。本實驗室胰腺癌Panc-1細胞系有效表達GPC1，而乳腺癌ZR-75-1細胞系GPC1抗原表達低，考慮到后續GPC1適配體在細胞水平和體內水平的功能研究，我們構建了人GPC1蛋白和螢光素酶共表達質粒，用慢病毒包裝的方法獲得穩定的Luc-ZR-75-1GPC1細胞系。Luc-ZR-75-1GPC1細胞系同時也表達螢光素酶，此細胞株適用于后續動物體內活體成像腫瘤模型，可用于靶向GPC1適配體與Luc-ZR-75-1GPC1腫瘤的共定位，也是腫瘤體內生長、治療及轉移相關研究的理想腫瘤模型。

圖2 適配體二級結構預測

圖3 候選適配體與GPC1結合親和力和特異性

以GPC1為靶點篩選具有特異性和親和力的適配體，經過10輪篩選，適配體得到了富集，獲得一條與Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1細胞系都具有特異性和親和力的適配體，但其構效關系仍有待進一步研究確證。篩選得到的適配體在細胞水平流式驗證結果略低于商品化抗體結合率，這可能與篩選壓力不足有關，也可能與篩選所用GPC1蛋白與細胞表達GPC1蛋白構象差異以及適配體未經修飾有關。

適配體的篩選是一個嚴格的過程，為得到親和力更高的適配體，須對篩選流程進一步完善。初始文庫的局限性、篩選過程中非特異性適配體及副產物的累積，以及結束篩選的指示標準都與適配體篩選的成功與否有關[23]。降低非特異性適配體的策略有：①穿插不相關靶點的反篩：在篩選過程中不可避免地存在對單鏈寡核苷酸的非特異性吸附作用，隨著篩選的進行，靶分子用量減少，與靶分子結合的適配體也逐漸減少，累積的非特異性適配體與特異性適配體同時擴增，但由于非特異性適配體量的優勢使其成為優勢擴增，這對適配體篩選是不利的，因此篩選過程中有必要穿插多次不相關靶點的反篩，以除去非特異性適配體；②優化PCR反應和程序：SELEX篩選過程中最重要的是PCR擴增適配體階段，循環數多會導致非特異性擴增，引物與模板的比例也起重要作用，在一般適配體PCR擴增階段，經常會發生2條鏈兩端互補或部分交叉互補從而形成異源雙鏈DNA[24-25]，異源雙鏈DNA的存在會促進雜交產物的形成，可能會導致文庫的異常及缺失，所以適配體都是以相對低的循環數在模板濃度較低的情況下進行PCR擴增，因此目前較為新穎的擴增方法是ddPCR技術，可以通過形成數萬個獨立微滴使各個微小反應體系分別進行，減少模板DNA間的相互干擾，在一定程度上減少了異源DNA的生成，也還可以通過增加反應循環數來提高適配體產量；③次級文庫ssDNA的制備方法也直接影響庫的容量和質量：經典的制備ssDNA方法是不對稱PCR技術，但由于PCR擴增存在優勢擴增，進一步的PCR可能導致親和力較高的適配體的損失。近些年磁珠法制備ssDNA文庫的方法被廣泛應用，生物素標記的雙鏈DNA可以和鏈霉親和素磁珠偶合，在強堿條件下使dsDNA解鏈變性，磁性分離收集堿液中的ssDNA文庫，這種方法簡化了制備ssDNA的過程，但由于過程中強堿的存在，ssDNA可能會發生部分降解，同樣有適配體庫的損失。λ外切酶[26]可以消化dsDNA成單鏈，對5′單端磷酸化標記的dsDNA比未標記的dsDNA消化速度高至少20倍，且對ssDNA的消化速度遠遠不及dsDNA，因此λ外切酶可用于制備次級文庫ssDNA，并且制備過程中具有特異性，更有效地防止適配體的丟失。隨著適配體篩選技術的不斷完善，可以快速篩選出高親和力高特異性的適配體，這對于推動適配體在分子識別技術及臨床中的應用無疑是一種更加有效的工具。

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