抗炭疽人源化單抗在炭疽芽孢致死小鼠模型中的治療效力評價

張端陽，李建民，劉威岑，付廣成，陳薇

軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的人畜共患的烈性傳染病。按照感染途徑不同，可以分為皮膚炭疽、胃腸炭疽、肺炭疽和注射炭疽4種[1]，其中肺炭疽的致死率高達90%[2]，其芽孢還是一種潛在的生物戰劑和生物恐怖襲擊的武器。炭疽芽孢桿菌的毒力因子包括2個方面，即聚-D-谷氨酸莢膜和炭疽毒素。其中莢膜能夠阻止細菌被吞噬細胞吞噬，毒素則包括護性抗原（protective antigen，PA）、致死因子（lethal factor，LF）和水腫因子（edema fator，EF）3種蛋白。單一的蛋白質均不能發揮作用，致死因子或水腫因子需要和保護性抗原結合成致死毒素（LF+PA；lethal toxin，LT）或水腫毒素（EF+PA；edema toxin，ET）才能發揮毒性作用。LT和ET在感染初期均能損傷先天免疫系統；而在感染后期，已有研究顯示LT和ET能夠分別破壞心血管系統和消化系統，造成不可逆的損傷及宿主死亡[3]。

現階段的治療策略主要有抗生素和治療性抗體2種。抗生素種類較多，一般聯合使用，能夠有效對抗敏感的炭疽芽孢桿菌，但不能清除體內的炭疽毒素。而治療性抗體不僅對炭疽芽孢桿菌有效，而且能夠有效中和炭疽毒素，降低毒素對宿主造成的損傷，提高存活率。目前國外研究獲得的炭疽毒素抗體主要是抗PA抗體[4]，已有2種抗PA單抗（Abthrax和Anthim）獲得美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于吸入性炭疽的治療[5-6]。5E11是本研究室前期研究獲得的抗PA人源化單抗，親和力達到6.63 nmol/L，已經在細胞模型和毒素攻擊大鼠模型中顯示出良好的保護效果[7]，因而也需要更多的動物模型進一步評價5E11的治療效力。在炭疽動物模型中，使用強毒株的芽孢攻毒最接近真實感染的情況，但這種實驗即使在規定的生物安全三級實驗室（BSL-3）中進行仍然具有很高的安全風險。而已有報道顯示，莢膜缺失的弱毒株（Sterne株）能夠致死DBA/2J小鼠[8]，據此我們用同樣缺失莢膜的疫苗株A16R對DBA/2J小鼠攻毒，發現同樣具有致死能力。進一步地，我們用不同劑量的芽孢對小鼠攻毒，計算出半數致死劑量（LD50），并用該模型評價單抗5E11的治療效力。

1 材料和方法

1.1 材料

6～8周齡雌性DBA/2J小鼠購自南京大學模式動物研究所；炭疽疫苗株A16R由本研究室保存；5E11單抗由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞表達，經純化后蛋白純度可達99%；重組炭疽保護性抗原（rPA）、致死因子（rLF）、水腫因子（rEF）均使用大腸桿菌BL21(DE3)表達，經純化后蛋白純度可達到95%以上；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人二抗和HRP標記的羊抗小鼠二抗均購自Ab?cam公司；化學發光顯色液購自Solarbio公司。

1.2 A16R半數致死劑量測定

將37只DBA/2J雌性小鼠分成6組，前5組每組6只，第6組7只，各組依次用不同劑量（103～105CFU）的A16R芽孢在小鼠背部皮下注射攻毒，之后每天至少觀察一次，連續觀察14 d，采用Bliss法計算A16R芽孢的LD50。

1.3 5E11在DBA/2J小鼠體內的藥代動力學參數測定

將15只DBA/2J雌性小鼠分成3組，每組5只，根據小鼠體重通過尾靜脈分別注射40、10和2.5 mg/kg的 5E11，在給藥后 0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、6 d、9 d、12 d、18 d、24 d、30 d采血，并采用 ELISA法測出血清中5E11的濃度，進而計算得到5E11在DBA/2J小鼠體內的藥代動力學參數。

1.4 5E11治療實驗

將50只DBA/2J雌性小鼠分成10組，每組5只，在第0 d用100倍LD50對50只小鼠攻毒（經背部皮下注射A16R芽孢），在攻毒后第1、2、3 d，每天對其中3組小鼠通過尾靜脈按體重分別注射40、10和 2.5 mg/kg的5E11；第 10組為對照組，在攻毒后1 h注射等體積輔料。之后持續觀察14 d，觀察小鼠存活等情況。14 d后，對存活的小鼠采血，ELISA檢測小鼠血清中抗PA、LF和EF的鼠多抗滴度，作為對A16R產生毒素的驗證。

1.5 ELISA實驗

在5E11的藥代動力學參數測定中，用純化的2 μg/mL rPA包被酶標板，4℃過夜；用PBST洗滌3次，每次5 min；用2%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉1 h；洗滌后加入PBS稀釋后的小鼠血清樣品或5E11（用于繪制標準曲線），于37℃孵育1 h；洗滌后加入HRP羊抗人二抗（1∶20 000稀釋），37℃孵育1 h；洗滌，加入顯色液，室溫顯色5 min，加終止液終止反應，最后在酶標儀上檢測D450nm值。在5E11治療實驗鼠多抗的檢測中，在不同的酶標板上分別用純化的2 μg/mL的rPA、rLF和rEF包被，4℃過夜;用PBST洗滌3次，每次5 min；用2%BSA于37℃封閉1 h；洗滌后加入PBS稀釋后的小鼠血清樣品并梯度稀釋，于37℃孵育1 h；洗滌后加入HRP羊抗鼠二抗（1∶20 000稀釋），37℃孵育1 h；洗滌，加入顯色液，室溫顯色5 min，加終止液終止反應，最后在酶標儀上檢測D450nm值。

1.6 統計分析

采用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析；采用Bliss法計算LD50；對于LD50測定和5E11治療實驗，繪制Kaplan-Meier生存曲線并用log-rank檢驗進行分析；采用Phoenix WinNonlin 6.1軟件計算5E11在小鼠體內的藥代動力學參數。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A16R半數致死劑量

從圖1可見，芽孢攻毒劑量為103～105CFU時，隨著攻毒劑量的提高，小鼠的存活率整體上呈下降趨勢。攻毒劑量為1×103CFU，小鼠存活率100%；當攻毒劑量達到2.4×105CFU時，小鼠全部死亡，死亡時間集中在4～5 d之間。用Bliss法計算得到的LD50約為7.8×103CFU。

2.2 5E11藥代動力學參數

3組小鼠經尾靜脈分別注射40、10和2.5 mg/kg的5E11后，根據ELISA測出的各時間點小鼠血清中的抗體濃度，計算得到的藥代動力學參數見表1。比較3組ELISA結果，隨著給藥劑量的提高，血清中抗體的濃度近似成比例上升。40、10和2.5 mg/kg的5E11在小鼠體內的平均半衰期分別為168、201和176 h。

2.3 5E11藥效學結果

攻毒后用5E11治療的生存曲線如圖2所示，攻毒后1 d給藥的3個組均100%存活，表明3個給藥劑量均能提供完全保護，與對照組存在顯著性差異（P=0.0023）。攻毒后第2和3 d的給藥組生存率為40%～80%，同一天給藥的3個組中小鼠的存活率沒有明顯的劑量依賴性。對照組全部死亡，死亡時間為4～5 d。對于攻毒14 d后存活的小鼠，采血檢測抗炭疽毒素多抗滴度，不同時間給藥的3個高劑量組結果見表2，3個組抗PA和抗LF的多抗滴度均為103～104量級，表明A16R菌株在感染宿主過程中確實產生了毒素并激起了小鼠的體液免疫應答。抗EF多抗滴度最高只到102量級，推測可能是炭疽桿菌產生EF較少，也有可能是EF免疫原性較低所致。

圖1 A16R芽孢攻擊小鼠模型生存曲線

表1 5E11在DBA/2J小鼠體內藥代動力學參數（x±s）

圖2 5E11治療給藥生存曲線

表2 存活小鼠抗炭疽毒素多抗滴度幾何均值

3 討論

目前治療吸入性炭疽還是以抗生素為主，國內尚未批準可用于治療吸入性炭疽的單克隆抗體。本研究室前期研究獲得的抗炭疽PA單抗5E11是一株高親和力中和單抗，已在細胞和大鼠模型中表現出良好的中和能力[7]。本研究使用炭疽疫苗株A16R攻毒DBA/2J小鼠建立致死模型，并用該模型評價了5E11的效力，結果表明5E11具有良好的保護效果。

在建模部分，我們用多個不同劑量的A16R芽孢攻擊小鼠，通過Bliss法計算得到的LD50為7.8×103CFU。而后我們通過ELISA實驗測出了5E11在小鼠體內的藥代動力學參數，其平均半衰期為7～8 d。在藥效學部分，我們根據已建立的致死模型，用100倍LD50的A16R芽孢攻擊小鼠，之后的第1、2、3 d，每天對其中3組注射幾種不同劑量的5E11，結果顯示攻毒后1 d給藥的幾個劑量組均能完全保護，攻毒后2～3 d給藥能達到40%～80%的保護效力，說明攻毒后給藥時間影響治療效果，越早越好，而不同的給藥劑量差別不大。對于存活小鼠進行的抗炭疽毒素多抗滴度檢測，驗證了A16R菌株在感染小鼠過程中確實產生毒素，并可激起小鼠體液免疫應答。

綜上所述，炭疽疫苗株A16R攻毒DBA/2J小鼠模型可用于評價抗炭疽單抗治療效力，5E11在芽孢攻擊小鼠致死模型中表現出良好的保護效果，具有緊急治療炭疽芽孢感染導致的急性炭疽的潛力。

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