馬爾堡病毒糖蛋白GP1亞基的真核表達與純化

張冠英，遲象陽，范鵬飛，房婷，吳詩坡，陳旖，王美榮，陳鄭珊，于長明，陳薇

軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）是一種烈性病原體，感染人和非人靈長類動物可引起嚴重的急性出血熱病，病死率超過80%。MARV可以通過血液、唾液、排泄物及嘔吐物等體液傳播。MARV與2014年在西非肆虐的埃博拉病毒同屬絲狀病毒科，為單股負鏈RNA病毒，基因組全長約19 kb，編碼7個結構蛋白，其中糖蛋白（glyco?protein，GP）在病毒黏附、進入細胞過程中發揮重要作用[1]，是抗體和疫苗研究的關鍵靶標。

GP為Ⅰ型跨膜糖蛋白，在病毒膜表面以三聚體的形式存在，每個單體由通過二硫鍵連接的GP1和GP2亞基構成。GP1包括受體結合區域（receptor binding region，RBD）、2個高度糖基化的區域聚糖帽（glycan cap，GC）和粘蛋白區（mu?cinlike domain，MLD）；GP2包含內融環（internal fusion loop，IFN）和 跨 膜 區（transmembranedo?main，TM）[2-3]。目前已報道的很多MARV的抗體結合表位都位于GP1亞基[4-6]，因此表達構象正確、生物學活性良好的GP1，對于篩選和檢測MARV抗體十分重要。在本研究中，我們構建了GP1的真核表達載體，并在哺乳動物細胞中表達獲得可溶性GP1，為MARV抗體和疫苗的檢測與評估提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Expi293細胞，pcDNA3.4、pDC316-MAGPopt質粒、炭疽單抗8A7由本實驗室保存；大腸桿菌Top10感受態細胞購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ，T4DNA連接酶購自NEB公司；膠回收試劑盒購自Omega公司；去內毒素質粒小提試劑盒購自Promega公司；Ex?pi293細胞培養基及轉染試劑購自ThermoFisher公司；HisTrap預裝柱購自 GE Healthcare公司；West?ern化學發光顯色液購自Millipore公司；羊抗人IgG抗體（HRP）及Anti-His抗體（HRP）抗體購自Abcam公司；結合于GP1亞基的MARV特異單抗rMR191、rMR78由本實驗室重組表達；TMB單組分顯色液、ELISA終止液購自索萊寶公司。

1.2 重組表達質粒構建

pDC316-MAGPopt包含經人密碼子優化后的Angola株MARV GP的全長基因序列，并用tPA信號肽替換了病毒原始的信號肽。以pDC316-MAGPopt為模板，設計上游引物（CCGGAATTCG CCGCCACCATGGACGCCATGAAGCGG）和下游引物（CCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTC GCTTCCGGCGGAAGTA）PCR擴增GP1片段，上游引物含EcoRⅠ酶切位點，下游引物含6×His標簽和HindⅢ酶切位點（PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共30個循環；72℃再延伸10 min），回收PCR產物，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切后的目的基因片段與經同樣雙酶切的pcDNA3.4質粒連接，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，挑取單克隆由生工生物工程股份有限公司測序，選取正確克隆提取質粒pcDNA3.4-GP1。

1.3 GP1在哺乳動物細胞中的表達

轉染前一天，接種2×106細胞到30 mL Ex?pi293 Expression Medium 中 ，在 5% CO2、37℃ 、120 r/min條件下懸浮培養；轉染當天，檢測細胞密度達 3×106/mL 時，取 80 μL ExpiFectamine293轉染試劑加入1.5 mL培養基中，混勻后室溫孵育5 min；取 30 μg構建的表達載體 pcDNA3.4-GP1加入1.5 mL培養基中，混勻后與含有轉染試劑的培養基混合，室溫孵育25 min，然后加入細胞培養瓶中；培養12 h后，在細胞培養瓶中加入150 μL轉染增強劑1和1.5 mL轉染增強劑2；繼續培養84 h后，將細胞培養物3000 r/min離心20 min，留上清。

1.4 Western印跡檢測蛋白表達

取細胞表達上清，加入含DTT的6×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，離心后上樣，電泳結束后轉移蛋白到硝酸纖維素膜上，電轉條件為300 mA、1 h；用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入rMR191（0.5 μg/mL）和 Anti-His抗體（1∶2000 稀釋）室溫孵育1 h，洗膜后再分別加入帶HRP的二抗，再次洗膜后滴加化學發光試劑，在化學發光成像系統中曝光。

1.5 Histrap柱親和層析純化GP1

用0.22 μm濾膜抽濾Expi293細胞表達上清，Histrap親和柱用平衡緩沖液（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）平衡后上樣，上樣結束后再平衡，用洗脫緩沖液（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）梯度洗脫蛋白，收集洗脫峰。

1.6 ELISA檢測GP1的免疫反應性

包被 1 μg/mL 純化的 GP1，4℃孵育過夜；PBST洗滌4次后，用2%BSA于37℃封閉1 h；洗滌后加入初始濃度100 μg/mL的rMR191、rMR78、8A7，以1/3梯度稀釋，37℃孵育1 h；洗滌后加入HRP標記的羊抗人二抗，37℃孵育1 h；洗滌，加入TMB單組分顯色液顯色6 min，加入終止液，讀取D450nm/D630nm值。

2 結果

2.1 GP1表達質粒的構建與鑒定

PCR擴增得到1370 bp的GP1片段（圖1），經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到pcDNA3.4載體，雙酶切構建好的pcDNA3.4-GP1表達載體，得到6000和1370 bp條帶（圖2），說明目的基因克隆到pcDNA3.4載體。基因測序結果與原序列一致，沒有堿基缺失與突變。

2.2 Western印跡檢測蛋白表達

將真核表達質粒pcDNA3.4-GP1瞬時轉染到Expi293細胞中進行表達，分別用抗MARV GP1的抗體rMR191（圖3A）和抗His標簽抗體（圖3B）作為一抗對表達上清進行Western印跡檢測。結果顯示，在還原條件下，檢測到相對分子質量為120 000～250 000的條帶，條帶呈彌散狀的原因是GP1含有大量糖基化位點，糖基化修飾使得蛋白的相對分子質量不均一。

2.3 ELISA檢測GP1的免疫反應性

用純化的GP1包被酶聯板，對抗MARV GP1的單抗rMR78、rMR191以及作為對照的炭疽單抗8A7進行檢測，結果見圖4，2株特異抗體可以與GP1結合，而對照抗體8A7不能結合GP1。提示哺乳動物細胞表達的GP1構象正確，具有良好的免疫反應性。

圖1 PCR擴增GP1基因

圖2 重組質粒pcDNA3.4-GP1的雙酶切鑒定

3 討論

MARV是一種烈性病原體，嚴重威脅人類的生命健康，但目前國際上尚無獲批的疫苗與特異性治療藥物[7]。MARV糖蛋白是目前疫苗和抗體研究的主要靶點，獲得純化的蛋白對研究MARV有重要意義。

目前表達絲狀病毒GP主要利用原核表達系統或昆蟲細胞表達系統[8-11]。原核表達系統體系成熟，可以在較短時間內獲得基因表達產物，但是也存在一些難以克服的缺點：如目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。昆蟲細胞表達系統能夠對目的蛋白做翻譯后修飾，但這種修飾存在一定的限度；其糖基化位點與在哺乳動物細胞中一樣，但寡糖鏈的性質有所不同，無法產生復雜的糖基側鏈[12]。哺乳動物細胞表達真核蛋白可以較為準確地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等翻譯后加工過程，產生的蛋白具有良好的生物學活性，且接近蛋白的天然構象，另外可溶性表達降低了檢測和純化目的蛋白的難度[13]。

圖3 Western印跡鑒定 GP1（A：rMR191；B：Anti-His）

圖4 ELISA鑒定Expi293細胞表達的GP1

MR78和MR191是Flyak等制備的2株MARV的中和抗體，它們結合的抗原表位都位于GP1亞基，但結合角度略有不同。本實驗室重組表達了這2株抗體，并用它們對GP1進行檢測，發現2株抗體都可以與GP1結合，提示重組表達的GP1構象正確，可用于中和抗體篩選與中和表位鑒定。

本實驗在哺乳動物細胞中對MARV糖蛋白GP1亞基進行重組表達，構建了真核表達載體pcDNA3.4-GP1，瞬時轉染Expi293細胞，在細胞培養上清中檢測到可溶性表達的目的蛋白，純化后的蛋白通過ELISA鑒定構象正確，具有免疫反應性。本研究獲得了GP1亞基，對絲狀病毒糖蛋白的表達有借鑒意義，為MARV疫苗的評價、特異性單抗的篩選及抗體的中和機制研究等提供了有效的生物材料。

[1] Brauburger K,Hume A J,Muhlberger E,et al.Fortyfive years of Marburg virus research[J].Viruses,2012,4:1878-1927.

[2] Hashiguchi T,Fusco M L,Bornholdt Z A,et al.Struc?tural basis for Marburg virus neutralization by a crossreactive human antibody[J].Cell,2015,160:904-912.

[3] Nanbo A,Imai M,Watanabe S,et al.Ebolavirus is in?ternalized into host cells via macropinocytosis in a vi?ralglycoprotein-dependentmanner[J].PLoS Pathog,2010,6:e1001121.

[4] Flyak A I,Ilinykh P A,Murin C D,et al.Mecha?nism ofhuman antibody-mediated neutralization of Marburg virus[J].Cell,2015,160:893-903.

[5] Froude J W,Pelat T,Miethe S,et al.Generation and characterization of protective antibodies to Marburg vi?rus[J].MAbs,2017,9(4):696-703.

[6] Fusco M L,Hashiguchi T,Cassan R,et al.Protective mAbs and cross-reactive mAbs raised by immuniza?tion with engineered Marburg virus GPs[J].PLoS Pat?hog,2015,11:e1005016.

[7] Mire C E,Geisbert J B,Borisevich V,et al.Therapeu?tic treatment of Marburg and Ravn virus infection in nonhuman primates with a human monoclonal antibody[J].Sci Transl Med,2017,9(384):eaai8711.

[8] Zou Z,Misasi J,Sullivan N,et al.Overexpression of Ebola virus envelope GP1 protein[J].Protein Expr Pur?if,2017,135:45-53.

[9] Clarke E C,Collar A L,Ye C,et al.Production and purification ofFilovirusglycoproteinsin insectand mammalian cell lines[J].Sci Rep,2017,7:15091.

[10]Das D,Jacobs F,Feldmann H,et al.Differential ex?pression of the Ebola virus GP(1,2)protein and its fragments in E.coli[J].Protein Expr Purif,2007,54:117-125.

[11]Lee J E,Fusco M L,Hessell A J,et al.Structure of the Ebola virusglycoprotein bound to an antibody from a human survivor[J].Nature,2008,454:177-182.

[12]范翠英,馮利興,樊金玲,等.重組蛋白表達系統的研究進展[J].生物技術,2012,22:76-80.

[13]畢永春.利用哺乳動物細胞表達外源蛋白的研究進展[J].醫學分子生物學雜志,2001,23:299-301.