截短型馬爾堡病毒包膜糖蛋白的原核表達純化及鑒定

聞雁波，吳詩坡，侯利華，陳薇

軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）屬于絲狀病毒科，是一種能夠引起急性出血熱的烈性病原體，具有極高的致死率[1]。MARV為單股負鏈RNA病毒，共編碼7種結構蛋白，即NP、VP35、L、VP30、VP24、GP、VP40[2]，其中包膜糖蛋白（glyco?protein，GP）能夠介導病毒進入細胞，已被證實是保護性抗原，因此通常將其作為疫苗研制的靶標抗原[3]。目前，世界上尚無批準上市的馬爾堡病毒疫苗，而由于其高度的致死性以及被用作生物戰劑的可能性[4]，研發針對此病毒的安全有效的疫苗刻不容緩。我們以MARV GP為研究對象，設計并構建4種截短型GP，利用大腸桿菌表達純化，獲得了純度較高、抗原性良好的截短GP，可用于MARV疫苗的免疫原性及MARV GP抗體的結合活性評價。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態細胞Top10、BL21購自天根生化有限公司；質粒pET-32a、pPDC316-MAGPopt為本實驗室保存；引物由生工公司合成；Ex-Taq酶、凝膠回收、質粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；HisTrap Ni柱、HiTrap Q柱購自GE公司；HRP羊抗鼠IgG二抗購自Abcam公司；化學發光顯色液購自Millipore公司。

1.2 原核表達質粒構建

根據MARV GP親疏水性質設計4種GP抗原（圖1），以pDC316-MAGPopt為模板擴增基因片段MAGP40-289、MAGP148-526、MAGP240-526和 MAGP258-526，回收PCR產物，酶切后連接pET-32a載體，轉化感受態大腸桿菌Top10，涂氨芐西林抗性平板過夜，挑單克隆進行平板劃線，同時菌落PCR鑒定陽性克隆，將陽性克隆送生工公司測序，測序引物為T7-F、T7-R，序列正確的克隆提質粒進行后續實驗。

1.3 重組蛋白誘導表達

鑒定正確的陽性克隆質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，涂布氨芐西林抗性LB平板，過夜培養后，挑單克隆在新的氨芐西林抗性LB平板上劃線培養，同時再次做菌落PCR鑒定（應為陽性）。從劃線平板上挑取各對應轉化菌到5 mL含氨芐西林（100 μg/mL）的 LB培養基中，37℃、220 r/min振蕩培養，菌液D650nm值達0.6～0.8時加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，28℃誘導表達6 h，3000 r/min離心10 min收集菌體沉淀，加入1 mL PBS重懸，超聲波破碎5 min，12 000 r/min離心10 min，分別取上清、沉淀（用等體積PBS重懸），加入6×SDS-PAGE上樣緩沖液，99℃加熱5 min，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達。

圖1 4種截短型GP結構示意圖

1.4 重組蛋白大量表達及純化

將甘油保存的陽性克隆菌液按1∶100轉接到5 mL含氨芐西林（100 μg/mL）的LB培養基中，37℃、220 r/min振蕩培養過夜，次日將5 mL菌液加到1 L含氨芐西林（100 μg/mL）的LB培養基中，37℃、220 r/min振蕩培養，菌液D650nm值達0.6～0.8時加入1 mmol/L IPTG，28℃培養6 h，8000 r/min離心5 min收集菌體，用80 mL緩沖液（含20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl）重懸，轉移到100 mL燒杯中，置于冰水混合物上進行超聲波破碎（工作時間5 s，間隔時間5 s，超聲時間15 min），超聲后溶液12 000 r/min離心20 min，取上清進行純化。純化儀開機裝上Ni柱后，用去離子水走2～3個柱體積，隨后過100 mmol/L NiSO4溶液至柱子變為均一綠色，電導值平衡，再用去離子水過2～3個柱體積，用緩沖液（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl）平衡柱子至電導值穩定。超聲后上清溶液過Ni柱上樣，用洗脫緩沖液（含20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑）進行線性梯度洗脫，洗脫完畢用50 mmol/L EDTA洗脫Ni離子，用去離子水、20%乙醇清洗柱子，Sepharose Q柱純化過程與Ni柱類似，將Ni柱純化后的收集峰用緩沖液（20 mmol/L Tris，10 mmol/L NaCl，pH8.0）稀釋至 1/10后上樣，用緩沖液（20 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，pH8.0）進行線性梯度洗脫。收集峰加SDS上樣緩沖液，加DTT，99℃加熱5 min后SDS-PAGE分析純化結果。

1.5 Western印跡

純化后的MAGP240-526蛋白經SDS-PAGE，轉到硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，用實驗室制備的Ad5-MAGPopt疫苗候選株免疫后的小鼠血清（1∶500稀釋于5%脫脂牛奶中）室溫孵育1 h；TBST洗滌4次，每次7 min；加入HRP羊抗兔二抗，室溫孵育 1 h；TBST洗滌4次，每次7 min；淋加化學發光顯色液反應片刻后曝光。

1.6 ELISA實驗

MAGP240-526蛋白以2 μg/mL的濃度包被酶標板，4℃包被過夜，次日用PBST洗滌3次，每次5 min；用5%牛血清白蛋白于37℃封閉1 h；PBST洗滌3次后，分別加入Ad5-MAGPopt免疫的小鼠血清、猴血清（起始稀釋率為1/100，1/3倍比稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，分別加入HRP羊抗鼠、羊抗猴二抗（1∶20 000稀釋），37℃孵育1 h；洗滌，加100 μL TMB單組分顯色液，37℃顯色6 min，加入終止液終止反應，測定D450nm值。

2 結果

2.1 重組表達載體的構建

PCR 擴增 DNA 片段 MAGP40-289，MAGP148-526，MAGP240-526，MAGP258-526后核酸電泳結果顯示條帶大小正確（圖2）。將擴增產物酶切后插入原核表達載體pET-32a，該載體含有Trx蛋白基因和His標簽，有利于目的蛋白的融合表達及后期用Ni柱純化[5]。重組質粒 pET-32a-MAGP40-289、pET-32a-MAGP148-526、pET-32a-MAGP240-526和 pET-32a-MAGP258-526測序結果與原序列一致，堿基序列未發生突變。

2.2 目的基因的誘導表達及純化

將重組質粒pET-32a-MAGP40-289、pET-32a-MAGP148-526、pET-32a-MAGP240-526、pET-32a-MAGP258-526分別轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，28℃誘導表達，菌體超聲波破碎后行SDS-PAGE鑒定，只有pET-32a-MAGP240-526能夠可溶表達于上清中（圖3），其他構建載體雖表達目的蛋白，但大多以包涵體形式存在，純化、復性步驟繁瑣。對MAGP240-526進行大量表達純化，經先Ni柱再陰離子柱的兩步純化法獲得純度為90%的截短蛋白（圖4）；Lowry法測定蛋白濃度后計算得出，1 L菌液誘導后獲得的蛋白產量約為17.4 mg。

用Ad5-MAGPopt疫苗候選株免疫后的小鼠血清對純化后的MAGP240-526蛋白進行Western印跡檢測，在相對分子質量 40×103～50×103處有明顯條帶（圖5）。

圖2 PCR擴增4種截短型GP片段

2.3 ELISA分析抗原特異性

用純化后的截短蛋白以2 μg/mL的濃度包被酶聯板，對用Ad5-MAGPopt疫苗候選株免疫過的小鼠血清、猴血清進行ELISA檢測，結果顯示我們制備純化的截短抗原能與馬爾堡疫苗候選株激發的抗體發生特異性結合（圖6）。其中小鼠血清本底水平較低，D450nm值低于0.1；而猴血清本底水平較高，D450nm值在0.6左右。

圖3 SDS-PAGE分析截短蛋白的表達

圖4 SDS-PAGE分析MAGP240-526Ni柱、Q柱純化后樣品

圖5 純化后MAGP240-526蛋白的Western印跡

圖6 截短抗原MAGP240-526的ELISA檢測

3 討論

MARV具有極高的致死率，是潛在的生物戰劑，目前世界上尚無批準上市的疫苗[6]。GP是MARV的主要抗原成分，也是疫苗研制的靶標抗原。由于MARV屬于第四級危害微生物，與活病毒相關的操作必須在生物安全四級實驗室中進行[7]，利用滅活病毒作為抗原進行疫苗的抗體水平評價是比較好的方法，而我國目前還不具備此條件，因此，需要構建重組MARV GP來進行馬爾堡疫苗抗體水平的評價。

MARV GP表達于病毒包膜表面，介導病毒接觸、進入宿主細胞。GP以三聚體形式存在，每個單體由GP1和GP2亞單位構成，GP1與GP2通過二硫鍵相連。其中GP1包含受體結合區和重度糖基化的粘蛋白區，而GP2則含有2段7個重復序列及跨膜結構域。病毒通過胞吞作用進入細胞，在內體中，GP經宿主細胞的組織蛋白酶剪切移除粘蛋白區和聚糖帽，使細胞能夠與NPC1受體結合[8]。由于表達全長GP具有一定難度，因此在本研究中，為了易于可溶性表達及純化，我們對GP序列進行親水性分析，選擇了4段親水性良好的片段，構建了4個原核表達載體，經過誘導表達，SDS-PAGE分析，篩選出一個可溶性表達良好的片段MAGP240-526。將該蛋白進行大量表達，純化時發現，僅經Ni柱純化獲得的蛋白純度太低，不能用于后續ELISA評價實驗，于是對純化條件進行了摸索和嘗試，最終發現經Ni柱純化后，對收集峰進行稀釋換液并用Q柱進行第二次純化，得到的蛋白純度較高，Western印跡和ELISA檢測顯示該蛋白具有良好的MARV GP特異性，可以用于后續的MARV GP抗體水平檢測。

綜上所述，本研究獲得了MARV GP截短抗原MAGP240-526，可作為MARV疫苗免疫學評價的抗原，為馬爾堡病毒的疫苗、抗體研發及評價奠定了基礎。

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