干擾血紅素加氧酶-1改善黑色素瘤細胞對順鉑耐藥性的機制研究

程小耕,王梓樂，畢敬濤，汪琳，董志

1.重慶醫科大學 藥學院生化與分子藥理研究室，重慶 400016；2.西南大學 動物科技學院，重慶 400715；3.北京積水潭醫院，北京 100035；4.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026

黑色素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤[1]，盡管已有長期且廣泛的研究，但由于內質網應激保護、過表達多種耐藥性蛋白及有效的DNA修復機制等多種復雜表型，以及轉移速度快、惡性程度高、對化療放療均不敏感等特性使其難以治愈。鉑類化合物是治療黑色素瘤比較有效的藥物，因此研究黑色素瘤對順鉑（cislpain，DDP）化療敏感性提高的方法有廣闊的臨床應用前景。

血紅素加氧酶-1（heme oxygnase-1，HO-1）是一種廣泛存在于哺乳動物體內的抗氧化防御酶，是降解游離血紅素重要的限速酶，其代謝終產物具有抗細胞凋亡、抗炎癥和保護細胞等特性[2]。近年來大多數研究都證實HO-1在人體惡性腫瘤組織中異常高表達[3]，對細胞的保護作用與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為有著密切的關系，同時在化療過程中是腫瘤產生抵抗反應的重要因素[4]。然而迄今，HO-1基因參與皮膚黑色素瘤化療耐藥及其機制的研究鮮見報道。在此，我們利用慢病毒介導的RNA干擾技術沉默HO-1基因的表達，觀察干擾前后腫瘤細胞對順鉑敏感性的變化，探討HO-1在黑色素瘤細胞耐藥機制中的作用，為尋找逆轉耐藥途徑提供理論基礎，并在黑色素瘤的臨床治療中發現新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK-293T細胞、人皮膚黑色素瘤細胞A375由本實驗室保存，采用含10%胎牛血清的DMEM培養液，于37℃、5%CO2孵箱中培養。硝酸纖維素膜購自Asra公司；pLKO.1-TRC、psPAX2和pMD2.G質粒購自Addgene公司；質粒提取及凝膠回收試劑盒購自康為世紀公司；反轉錄試劑盒、TRlzol購自Promega公司；嘌呤霉素購自碧云天公司；LipofectAMINE 2000轉染試劑盒購自Invitro?gen公司；細胞DMEM培養液及胰酶購自HyClone公司；胎牛血清購自Natocor公司；順鉑購自江蘇豪森藥業股份有限公司；抗體β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3購自CST公司；引物合成及序列測定由上海生工公司完成。

1.2 HO-1基因shRNA慢病毒載體的構建與鑒定

利用軟件設計5條靶序列作為HO-1的RNA干擾序列，構建質粒，干擾HO-1質粒共轉染293T細胞，Western印跡篩選有效靶點，根據其對HO-1的抑制效率，最終挑選的有效RNAi序列為5′-AATGCTGAGTTCATGAGGAAC-3′。 根 據 挑 選 的RNAi序列設計的HO-1短發夾框架結構為F（5′-CCGGAATGCTGAGTTCATGAGGAACCTCGAGGTTC CTCATGAACTCAGCATTTTTTTG-3′）和 R（5′-AAT TCAAAAAAATGCTGAGTTCATGAGGAACCTCGAG GTTCCTCATGAACTCAGCATT-3′），包含 19個堿基的正義鏈、6個核苷酸序列的loop環和互補19個堿基的反義鏈，在正義鏈和反義鏈的5′端分別加上限制性核酸內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ的酶切位點。合成后退火成雙鏈，與經AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切消化后的慢病毒載體pLKO.1-TRC連接，轉化感受態大腸桿菌并挑選陽性重組克隆進行PCR鑒定，連接成功的載體送公司測序，序列測定無誤后將質粒命名為pLKO.1-TRC-HO-1。按照質粒提取純化試劑盒的說明書純化pLKO.1-TRC-HO-1和作為對照的空載體質粒pLKO.1-TRC，用于轉染。

1.3 慢病毒包裝

在25 mL細胞培養皿中接種對數生長期的293T細胞，當細胞密度約70%時將重組shRNA表達載體pLKO.1-TRC-HO-1、psPAX2和pMD2.G質粒與相應體積的Opti-MEM混合均勻，將DNA與LipofectAMINE 2000混合液轉移至293T細胞的培養液中，8 h后更換正常培養基，48 h后收集細胞上清液，4℃、4000 r/min離心10 min除去細胞碎片，用0.45 μm濾器過濾上清液于40 mL超速離心管中，離心進行病毒濃縮、分裝和保存。

1.4 HO-1低表達穩定株的建立

將生長良好的A375細胞在病毒感染前一天接種于培養瓶中，使其密度在感染時達70%～80%，加入 100 μL 病毒原液和 4 μL Polybrene（2 mg/mL），混勻，孵育12 h后更換完全培養基繼續培養，48 h更換成含嘌呤霉素（1 μg/mL）的完全培養基，隨后每2～3 d用該培養基換液一次，連續培養10 d后提取RNA和蛋白質檢測。

1.5 細胞RNA提取和RT-PCR

用TRIzol提取細胞總RNA，逆轉錄參閱試劑盒說明書進行。用CFX Connect實時定量PCR儀（Bio-Rad公司）對上述獲得的cDNA進行檢測，總體積為20 μL（反應循環PCR擴增標準程序：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃延伸30 s，共 40個循環，延伸階段收集熒光信號，循環結束后附加溶解曲線分析）。每例樣品均設3個平行復孔，重復3次，取均值，收集數據，測定各樣品的Ct值，計算目的基因的相對表達量為2-ΔΔCt。以持家基因GAPDH為內參照。相應引物序列見表1。

1.6 Western免疫印跡

收集細胞，棄去培養基，加入PBS清洗2次，加入200 μL蛋白裂解液，用細胞刮收集蛋白，12 000 r/min冷凍離心10 min，吸取上清，以BCA法進行蛋白定量。12%SDS-PAGE分離蛋白樣品，100 V電壓轉移1.5 h至硝酸纖維素膜，預染蛋白質分子量標準標識蛋白位置。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用含5%BSA的TBST稀釋一抗，4℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，ECL顯色。

1.7 平板克隆形成實驗

用細胞計數板計數3000個細胞，將細胞接種于60 mm培養皿，培養1周后將細胞用PBS清洗2次，加入2 mL多聚甲醛固定30 min，棄去多聚甲醛，加入適量結晶紫溶液染色，1～2 min后用水清洗，拍照。

1.8 CCK-8法檢測HO-1敲低前后A375對順鉑敏感性的變化

收集病毒感染后的A375細胞，按5000個細胞接種于96孔板，每組設3個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，2組各加不同濃度的順鉑，48 h后每孔加入10 μL CCK-8，于培養箱中培養1 h，終止培養后用酶標儀測定各孔的D490nm值。

1.9 數據分析

目的基因的表達由RT-PCR結果計算的2-ΔΔCt和Image J軟件計算的Western印跡灰度值行統計，采用SPSS17.0統計軟件分析，所有數據均以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 HO-1低表達的穩定轉染細胞株的建立

重組質粒純化后，通過HO-1干擾慢病毒建立再轉染A375細胞48 h后，經嘌呤霉素篩選10 d，獲得具有抗性的單克隆細胞集落，發現在穩定細胞系中，HO-1干擾細胞（KD）形態略變細長，呈不規則形態（圖1A）。擴大培養后收取細胞總RNA和蛋白質，RT-PCR和Western印跡（圖1B）顯示HO-1穩定細胞株中的HO-1 mRNA相對水平顯著性下調（P＜0.001），蛋白水平也明顯下降。

2.2 HO-1基因影響A375細胞增殖能力

將3000個細胞分別接種于60 mm培養皿中培養7 d，細胞固定后用結晶紫染色，結果如圖2A，干擾HO-1穩定細胞系中細胞明顯少于正常A375細胞（對照）。CCK8法檢測結果顯示敲低HO-1后能夠明顯抑制細胞生長，差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖2B）。此結果表明干擾HO-1基因可抑制人黑色素瘤細胞的增殖能力。

表1 Real-time PCR所用的引物序列

2.3 沉默HO-1增強A375細胞對順鉑的敏感性

為研究在A375細胞中沉默HO-1對順鉑的敏感性，本實驗選用 4、5、6 μg/mL 順鉑分別處理A375和A375-shHO-1穩定細胞系，加藥48 h后結晶紫染色，結果顯示A375-shHO-1細胞存活率明顯低于A375細胞（圖3A）；顯微鏡下觀察，與A375細胞相比，A375-shHO-1細胞死亡率顯著增高，在加入4 μg/mL順鉑處理后A375還能保持其細胞形態，但A375-shHO-1細胞形態已發生明顯改變，甚至趨于凋亡（圖3B）。

為進一步研究細胞對不同濃度順鉑的敏感性，采用藥物濃度由低到高的梯度分別處理2種細胞，CCK8檢測細胞存活率，結果（圖3C）顯示在低濃度順鉑（0.25～6 μg/mL）處理的情況下，A375-shHO-1細胞的抑制率可高達50%，而A375細胞抑制率只有22.6%，濃度越低的情況下（0.25～1 μg/mL），A375-shHO-1細胞抑制率比 A375細胞高 8倍以上。在高濃度順鉑（8～20 μg/mL）處理的情況下，A375-shHO-1細胞與A375細胞的抑制率沒有明顯差異，20 μg/mL順鉑處理時兩者抑制率都達到約60%的高峰。這些結果表明沉默HO-1能加強細胞對藥物的敏感性，低濃度藥物處理效果更加明顯。

圖1 HO-1 RNAi慢病毒感染后穩定細胞株的HO-1表達

圖2 結晶紫染色和CCK8檢測細胞增殖情況

圖3 敲低HO-1后不同濃度順鉑處理的A375細胞存活率

2.4 順鉑處理后敲低HO-1促進細胞凋亡

流式細胞術結果顯示，在A375細胞中，敲減HO-1穩定細胞株凋亡率（5.74%）與對照組（4.16%）沒有明顯差異（圖4A）。當在A375細胞株中加入4 μg順鉑，其對照組和shHO-1穩定細胞株凋亡率都顯著提高，但shHO-1穩定細胞株凋亡率（48.32%）明顯高于對照組（22.89%），差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖4B）。

2.5 HO-1穩定敲低細胞經順鉑處理后凋亡相關蛋白的表達量增加

細胞經4 μg/mL順鉑處理后，real-time PCR檢測結果顯示，A375-shHO-1細胞與A375細胞相比，凋亡抑制基因Bcl-2的表達明顯降低（P＜0.05），而凋亡基因Bax的表達顯著增高（P＜0.01），總的Caspase-3水平無明顯變化（圖5A）。此外，2種細胞蛋白水平上檢測相關凋亡基因Bcl-2、Bax、Caspase-3及active caspase-3的表達，Western印跡結果顯示，敲低HO-1能夠降低Bcl-2蛋白表達，增加Bax的蛋白表達，并活化Caspase-3（圖 5B）。

3 討論

圖4 敲低HO-1的表達對A375細胞凋亡率的影響

順鉑是臨床上較為廣泛應用的抗癌藥物，目前用于乳腺癌、結腸癌、頭頸癌等多種腫瘤[5-6]，其作用機制主要是進入癌細胞的DNA堿基片段中，阻礙DNA的轉錄和復制，從而抑制腫瘤生長。然而化療藥物持續使用使癌細胞對化療藥物敏感性降低，從而產生對藥物抵抗，導致化療失敗，因此它的耐藥性成為亟待解決的問題之一。

血紅素加氧酶是血紅素氧化的限速酶，其降解衰老或破損的紅細胞并釋放出血紅素，是止血和氧化應激反應的重要分子。以往認為血紅素代謝產物不僅對機體無益，過量時還可對機體造成損害[7]。但深入的研究表明這些物質均具有細胞保護作用，可以抑制炎癥細胞釋放炎性因子，還可促進惡性腫瘤細胞的基因組不穩定性[8-9]。

研究發現，多種腫瘤細胞中均可見HO-1的高表達，在缺氧條件和放化療時表達更是明顯增加。HO-1的過量表達可能是腫瘤細胞適應較惡劣生長條件和產生放化療抗性的主要原因之一。有研究發現高HO-1表達可以誘導神經母細胞瘤等腫瘤細胞的耐藥性增加[10]。而近期有報道顯示HO-1在伊馬替尼治療慢性髓細胞性白血病中也參與了藥物的耐藥性[4]。在皮膚黑色素瘤治療中，HO-1對順鉑敏感性的影響機制尚未闡明，為此我們應用shRNA抑制HO-1的表達，在構建的穩定細胞株中發現A375-shHO-1細胞能夠抑制細胞生長。加入藥物順鉑處理后，HO-1敲減能增加A375對藥物順鉑的敏感性。

耐藥的產生與藥物外排、DNA損傷的增加及細胞增殖或凋亡信號通路改變密切相關[11-13]。HO-1已被證明與Nrf2通路有關，影響其他轉錄因子 STAT3、CDP、Brn-3、CBF和 AP-2，而這些因子都直接或間接參與DNA修復機制和凋亡[14-15]。本研究發現，在采用化療藥物順鉑處理后，HO-1敲低可促進凋亡并調節凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達。Bcl-2是一種原癌基因，具有抑制凋亡的作用，而Bax基因屬于Bcl-2家族，可與Bcl-2蛋白結合形成異源二聚體，抑制Bcl-2的功能，從而促進細胞凋亡[16]。本研究結果顯示敲低HO-1能夠上調Bax表達并抑制Bcl-2的表達，從而促進癌細胞凋亡。Caspase-3是白細胞介素1β轉化酶（ICE）家族成員，是主要的效應Caspase，在細胞凋亡中處于核心地位，活化后的Caspase-3更能夠調節凋亡相關線粒體通路及死亡受體通路，從而影響細胞生長。流式細胞術結果顯示，在化療藥物處理下HO-1敲減促進黑色素瘤細胞凋亡，并且能夠激活Caspase-3。

綜上所述，我們的研究結果表明HO-1敲低可促進細胞凋亡，從而增加A375細胞對化療藥物的敏感性，同時可調控相關凋亡基因來降低A375的耐藥性。本研究對黑色素瘤細胞化療藥物的開發研究及臨床耐藥性的解決提供了新的思路。

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