抗EPO抗體特性、分類及其相關純紅細胞再生障礙性貧血的發病機制及診治進展

張 晶 綜述 張承英 審校

抗EPO抗體相關純紅細胞再生障礙性貧血是一種應用重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)而引起的純紅細胞再生障礙性貧血(pure red cell aplasia，PRCA)，臨床上比較少見，其主要特點為rHuEPO治療無效，呈進行性貧血，特點為外周血中網織紅細胞及骨髓中紅系前體細胞絕對缺乏，而粒系和巨核系細胞數正常。1922年，Kaznelson首次將PRCA從再生障礙性貧血中分出。本病臨床上并不常見，其發病率約占再生障礙性貧血總數的3%[1]。隨著rhuEPO在臨床的廣泛應用，由其引起的不良反應—抗EPO抗體相關純紅細胞再生障礙性貧血也越來越受到臨床重視。筆者重點對該病的發病機制、診斷及治療進展進行綜述。

1 抗EPO抗體

1.1 特性 促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是由腎皮質腎小管周圍間質細胞和肝臟分泌的一種酸性糖蛋白，用于骨髓中紅系造血祖細胞，能促進其增殖、分化。它由分子量為18 399的166個氨基酸的成熟蛋白組成，其分子量約為30 400。人類EPO 基因定位于7號染色體長臂22區(7q22)，含有5個外顯子和4個內含子，細胞在分泌外顯子編碼的多肽時，將N-端27個氨基酸組成的前導肽剪切下來，經過移除末端氨基酸，在體內與骨髓紅系前體細胞表面的特異受體結合，抑制骨髓紅系前體細胞的凋亡，刺激骨髓紅細胞的生成和釋放，從而發揮生物學作用。1983年由Lin等[2]成功分離并克隆了EPO基因，1985年成功地克隆出人EPO互補脫氧核糖核酸(cDNA)和基因，開始利用基因工程技術表達了重組人EPO，即rHuEPO，并之后用于臨床實驗，1989年美國食品藥品管理局(FDA)正式批準rhuEPO 應用于貧血的臨床治療。目前隨著現代基因技術的發展，r-HuEPO已成功廣泛應用于臨床慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者，有研究顯示，慢性腎臟病患者對EPO反應性的降低是疾病進展的主要原因，體內炎性反應因子也能不同程度地降低機體對EPO的反應性[3]，所以說EPO可顯著延緩慢性腎臟病的進展[4-6]。此外，EPO還適用于癌癥、化療或者外科手術中異性輸血導致的貧血、失血后貧血和AIDS引起的貧血等，也可降低患者對輸血的需求，減少AIDS及病毒性肝炎等通過血液制品傳播疾病的發生幾率。

1.2 分類 臨床使用最廣的rHuEPO均為EPO基因經過體外重組后在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞中表達的糖蛋白，糖基對穩定蛋白的結構和生物活性非常重要，各種類型的rHuEPO氨基酸序列與天然EPO之間最主要區別為所含寡糖鏈的不同。rHuEPO可分為含寡糖39%的rHuEPO-α和含寡糖24%的rHuEPO-β，而抗EPO抗體介導的PRCA主要發生于前者。PRCA可分為原發性和繼發性，原發性常與形態異常有關，由編碼各種核糖體蛋白質的基因發生突變而導致[7]，繼發性可見于腫瘤(如胸腺瘤、淋巴瘤等)、病毒感染(肝炎病毒等)、自身免疫性疾病、藥物(如氯霉素、異煙肼、硫唑嘌呤等)、妊娠及rHuEPO相關等[8-10]，其原因可能跟T淋巴細胞功能異常，細胞因子分泌紊亂，致使骨髓產生受抑制有關[11，12]。

2 PRCA發病機制

目前，抗EPO抗體相關的PRCA發病機制尚不明確，研究發現其發病機制可能有以下方面：(1)給藥途徑。EPO相關PRCA患者的給藥途徑幾乎均為皮下注射。其局部皮膚可出現變態反應，從而促使全身免疫反應產生抗體，因為淋巴細胞在皮下，與靜脈給藥相比，皮下注射更易增加藥物的免疫原性，從而介導機體發生免疫反應[13]，但皮下注射EPO依然有其生物利用度高，減少過敏反應等不良反應的優勢。(2)穩定劑成分。1998年為防止瘋牛病等疾病的傳播， Epre等[14]使用聚山梨醇酯80代替白蛋白做為穩定劑成分，之后 EPO相關的PRCA發病數量也升高，由此推測EPO抗體產生與穩定劑聚山梨醇酯有關，尤其是溫度較高時，會引起rhuEPO分子聚集形成微粒，進入體內后觸發機體的免疫系統反應，引起EPO 抗原性改變，從而誘導抗EPO抗體的產生，PRCA多見于使用rHuEPO-α患者，這可能是因為rHuEPO-α所含的聚山梨醇酯較rHuEPO-β高[15]，當然也有皮下注射rHuEPO-β，如達依泊汀或HX575后患PRCA的病例[16]。(3)產品包裝。使用帶有無涂層橡皮塞(uncoated rubber stopper)的預充型Eprex也和rHuEPO相關的PRCA有關。研究認為，無涂層橡皮塞中的某種有機化合物(鎢或硅)能誘導蛋白質變性，導致蛋白質折疊形成聚合物，這對Eprex免疫原性的增加起到輔助作用，所以臨床建議使用帶有涂層橡皮塞的預充型Eprex，強化低溫鏈以及改變應用途徑。(4)其他因素。除上述原因，如透析管路、透析器，透析患者的微炎癥狀態，營養不良、電解質平衡紊亂，透析不充分，ACEI及ARB類藥物及免疫抑制劑的使用，脾亢及甲狀腺功能減退都能影響EPO抗體的產生。

3 診斷和治療

3.1 EPO相關的PRCA診斷 EPO抗體相關PRCA的診斷除臨床表現為應用rhuEPO過程中存在進行性貧血外，還要依靠骨髓象和血清抗EPO抗體的檢查。其診斷標準如下：(1)持續使用rHuEPO治療4周以上，在rHuEPO劑量不變或劑量增加時出現血紅蛋白以每周 5～10 g/L的速度快速下降，或需每周輸入1～2單位的紅細胞才能維持血紅蛋白水平。需排除透析不完全、缺造血原料等導致促紅細胞生成素治療反應低下的因素；(2)骨髓穿刺提示紅系祖細胞小于5%，粒系和巨核系無明顯改變；(3)化驗抗EPO抗體陽性。同時滿足以上3項即可診斷為PRCA。Slominski等[17]研究發現，血清中即使存在抗EPO抗體不一定會發生PRCA，抗EPO抗體所導致的PRCA患者也不一定應用過rHuEPO。

測定血清中EPO抗體水平，可了解其發病機制，同時可為糾正患者貧血癥狀提供依據。EPO抗體的檢測是診斷EPO相關的PRCA的重要依據。目前檢測血清中抗EPO抗體有多種方法：(1)放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)是最早出現、最精確的檢測方法，特異性高，但易出現假陰性；(2)酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)應用廣泛，但其靈敏度和特異性均低于RIPA；(3)生物傳感器免疫分析法(Biosensor immunoassay)操作復雜，靈敏度低，應用受限；(4)體外分析法是最直接的檢測方法，但不能精確分析抗體滴度及亞型。近年新興的光激化學發光免疫分析法(Light initiated chemiluminescence assay，LiCA)展示了未來檢測技術的發展趨勢，具有靈敏度高、操作簡便、性質穩定、易于微型化自動化等優勢。

3.2 治療 本病一旦確診后治療上首先應停用或避免應用所有種類的rhuEPO，并對嚴重貧血患者進行輸血對癥治療，治療緩解后仍應繼續停用 EPO 以免復發。Verhelst等[18]發現，除停EPO治療外，給予免疫抑制劑治療后，78%PRCA患者的抗EPO抗體轉陰，血紅蛋白較前有所升高。有文獻報道環孢素治療PRCA有效率為82%,是目前公認的治療繼發性PRCA首選藥，其機制可能是由于環孢素可逆性地抑制體內T淋巴細胞的功能和增殖，抑制淋巴因子的生成和釋放，調節T細胞亞群比例，同時可抑制 CD8 細胞活性及增殖，使 CD4/CD8 的比例恢復正常，繼而有效抑制骨髓造血，提高對激素的敏感性，減少不良反應的發生。兩藥聯合應用可從各個方面排除各種免疫異常因素，療效要大于單藥治療。但應注意長期應用免疫抑制劑會致免疫功能低下，易合并各種感染，治療過程中要監測淋巴細胞亞群。我院有報道顯示腎移植術后聯用嗎替麥考酚酯和他克莫司導致PRCA的病例，換用環孢素后骨髓涂片及血常規恢復正常[19]，也有部分報道顯示僅使用少量激素(潑尼松龍0.2 mg/kg)維持3個月病情得到緩解的病例[20]。Hirokawa等[21]報道 PRCA的患者初始免疫抑制治療緩解率顯著要高于復發后2次免疫抑制治療緩解率，治療中尤其要注意患者初始的病因治療及針對發病機制的免疫抑制治療，防止2次復發。采用腎移植治療PRCA患者緩解率達100%，其療程也在1個月內，提示腎移植治療方案非常可行，但因腎源缺乏，腎移植治療PRCA受到限制，此時可單用環孢素、環孢素+激素、激素+環磷酰胺進行治療，治療應一直持續到復查抗EPO抗體轉為陰性，網織紅細胞計數>20×109/L。近期我院1例PRCA患者經激素聯合環孢素治療，3個月內血紅蛋白恢復正常，化驗環孢素谷濃度平均為132.5 ng/ml，取得了比較好的治療效果。此外，大劑量靜注人血免疫丙種球蛋白(HD-IVIG)、血漿置換及單克隆抗體等生物制劑也為治療治療提供了可能。總之，應結合發病原因及免疫學情況確定PRCA具體的治療方案。

目前針對抗EPO抗體相關純紅細胞再生障礙性貧血的精準治療方案亟待進一步研究，近年來，在低氧誘導EPO基因的方面合成的缺氧誘導因子-脯氨酰羥化酶(HIF-PH)抑制劑，可上調EPO基因的表達，用于治療慢性腎臟病以及終末期腎病(ESRD)導致的腎性貧血患者，臨床上可減少PRCA的發生，相比于傳統的紅細胞生成素刺激藥(erythro poiesis stimulating agents，ESAs)，其造價便宜，給藥途徑方便[22]，通過模擬缺氧狀態，抑制HIF羥化降解的路徑，從而達到激活HIF，誘導EPO合成的目的，從而糾正貧血[23]。另外促紅細胞生成素擬肽(erythropoietin mimetic petide,EMP)中的代表藥物Peginesatide因其氨基酸序列與天然Epo氨基酸序列不存在同源性[24]，因此降低了引起PRCA的風險，可應用于抗EPO抗體相關純紅細胞再生障礙性貧血患者的治療[25]。

綜上所述，抗EPO抗體相關PRCA呈逐年上升趨勢，臨床應引起警惕。對于EPO持續治療無效，出現血紅蛋白及網織紅細胞計數絕對值進行性下降，而粒系和巨核系細胞數正常的患者應考慮PRCA可能，盡快完善骨髓穿刺及抗EPO抗體檢查，一旦確診應立即停用 EPO，治療上需結合患者的原發病、療效及藥物耐受情況采用個體化治療方案，若治療無效，可行腎移植治療。隨著EPO基因精準治療的發展，更多安全有效的藥物將會被應用于臨床，以使得更多的PRCA患者受益。