結(jié)核性腦膜炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法及其改進(jìn)策略

王義義 綜述 張 偉 審校

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis ,TBM)屬于神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，是非常嚴(yán)重的肺外結(jié)核病。TBM病變累及軟腦膜、蛛網(wǎng)膜、腦實(shí)質(zhì)、腦血管，是結(jié)核病死亡的主要原因之一，有很高的病死率和致殘率[1]。 TBM預(yù)后與診斷早晚以及治療是否及時(shí)有密切關(guān)系。由于TBM早期臨床表現(xiàn)特異性差，常被誤診為隱球菌性腦膜炎、化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎等疾病而延誤治療，因此臨床診斷困難，病死率和致殘率高。根據(jù)文獻(xiàn)[2,3]報(bào)道TBM病死率為10%～36.5%。及時(shí)診斷，早期治療是改善TBM預(yù)后，減少TBM死亡和致殘的重要策略之一，盡早明確診斷是治療成功的關(guān)鍵所在。根據(jù)2011年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的數(shù)據(jù)，仍有一大部分TBM的患者沒有得到及時(shí)的診斷和治療，因而致殘甚至死亡[4]。TBM的誤診率達(dá)到31.6%，早期1周內(nèi)診斷率僅為10%[1-4]。近年，TBM的實(shí)驗(yàn)室診斷方法取得很多進(jìn)展，臨床醫(yī)生需要了解實(shí)驗(yàn)室檢測方法，提高診斷水平。筆者旨在對目前TBM實(shí)驗(yàn)室診斷方法及改進(jìn)策略進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病原學(xué)檢查

1.1 抗酸染色 抗酸染色，也叫齊-尼染色法，由兩名德國醫(yī)師首先描述，已經(jīng)使用一個(gè)多世紀(jì)。在結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)鑒定中的作用舉足輕重，但是抗酸染色陽性率低，陽性發(fā)現(xiàn)要求的最低菌量為102個(gè)/ml，而可靠的陽性發(fā)現(xiàn)需要的菌量為104個(gè)/ml。TBM是少菌型結(jié)核病，腦脊液中的菌量只有100～102個(gè)/ml[5]。因此，抗酸染色在TBM診斷中陽性率低，文獻(xiàn)[6]報(bào)道只有10%～20%。改進(jìn)策略主要包括增大腦脊液量，延長鏡檢時(shí)間和使用熒光顯微鏡鏡檢。有研究報(bào)道，增加腦脊液的檢測量(>6 ml)，延長檢測時(shí)間可以提高陽性率到58%[6]。另有研究報(bào)道，熒光顯微鏡鏡檢能提高痰液抗酸染色的陽性率，提高10%的敏感度[7]。但是，對于肺外標(biāo)本，目前還沒有足夠的證據(jù)證實(shí)熒光檢測的診斷價(jià)值。

1.2 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) TBM患者腦脊液中的Mtb培養(yǎng)敏感度很低，培養(yǎng)時(shí)間長。據(jù)國外文獻(xiàn)[6, 8]報(bào)道，敏感度為36%～81.8%。傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)液需要8周培養(yǎng)確定陰性結(jié)果。在以肉湯為基礎(chǔ)的培養(yǎng)液中Mtb倍增時(shí)間明顯減少(13 dvs26 d)[9]，但是仍需要6周才可確定陰性結(jié)果。因此Mtb的培養(yǎng)鑒定只能作為TBM的納入檢驗(yàn)，而不能作為排除檢驗(yàn)。為了提高陽性率，有研究報(bào)道，延長培養(yǎng)時(shí)間至10周可以提高培養(yǎng)的陽性率[10]。為了縮短培養(yǎng)時(shí)間，一項(xiàng)來自瑞士的報(bào)道，研究了Mtb在雙相培養(yǎng)液中培養(yǎng)結(jié)果陽性出現(xiàn)的時(shí)間，結(jié)果顯示58.3%的培養(yǎng)陽性出現(xiàn)在14 d之內(nèi)，37.5%出現(xiàn)在21 d之內(nèi)，4.2%在28 d之內(nèi)，因此建議Mtb快速培養(yǎng)的時(shí)間可以縮短至4周[11]。

1.3 藥物敏感性鏡下檢測分析法 藥物敏感性鏡下檢測分析法(microscopic observation drug susceptibility, MODS)在2000年由 Caviedes等[12]提出。將腦脊液置于含有特異的液體培養(yǎng)液的微孔板中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察，Mtb形成特征性的索樣結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，腦脊液Mtb培養(yǎng)檢測時(shí)間中位數(shù)為6 d，敏感度為65%。MODS還可用于藥敏檢查，文獻(xiàn)[14]報(bào)道，異煙肼藥敏檢測結(jié)果的符合率為95.7%，利福平為96.8%。2011年WHO推薦MODS 作為Mtb培養(yǎng)及耐藥鑒定的方法之一。

2 分子生物學(xué)檢查

TBM是一種少菌型的結(jié)核病，因此病原學(xué)檢查的應(yīng)用受到限制。分子生物學(xué)技術(shù)為Mtb的檢測、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)提供了極大的方便。主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。臨床最常使用的是核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(nudeic acid amplification technology, NAATs)。自1990年開始NAATs用于腦脊液標(biāo)本中Mtb核酸的檢測[15]。NATTs可以檢測到的最低菌量為10個(gè)/ml以下的臨床標(biāo)本[16]。

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 是使用最為普遍的分子生物學(xué)檢查方法。可選擇的方法包括實(shí)時(shí)熒光PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法(TMA)[17]。對于PCR診斷TBM的敏感度和特異度沒有權(quán)威的數(shù)據(jù)評價(jià)，文獻(xiàn)報(bào)道差異懸殊。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的商業(yè)化試劑盒在腦脊液Mtb的檢測中敏感度低，據(jù)國外文獻(xiàn)[18]報(bào)道為56%。因此PCR不能用于TBM的排除診斷，也不能取代傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測。

2.2 Xpert MTB/RIF分析(Cepheid,Sunnyvale, CA) 可以在2 h內(nèi)檢測Mtb基因以及利福平耐藥。檢測過程全自動，只需兩歩人工步驟，手動時(shí)間不超過5 min。所檢測標(biāo)本中最低只需4.5個(gè)基因組。2010年WHO推薦Xpert MTB/RIF分析應(yīng)用于痰液Mtb的檢測。在痰液檢測中敏感度高于抗酸染色(98% vs 68%)。雖然WHO并未推薦其在腦脊液中的應(yīng)用，但是研究者也在探索Xpert MTB/RIF檢查在腦脊液中的應(yīng)用，并取得了成果。據(jù)文獻(xiàn)[19, 20]報(bào)道腦脊液中Xpert MTB/RIF的敏感度為27%～86%。但是由于樣本量小，評估還需要擴(kuò)大樣本。Xpert MTB/RIF檢測Mtb的同時(shí)可以用于利福平耐藥檢測，并被WHO推薦。但是Xpert MTB/RIF分析利福平耐藥的特異性較低，WHO推薦需要用傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)排除假陽性的結(jié)果[21]。

3 免疫學(xué)檢查

3.1 細(xì)胞免疫檢測技術(shù) γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)(Interferon Gamma Release Assay, IGRAs)是在全血中檢測機(jī)體對于Mtb抗原的免疫反應(yīng)，包括測定全血中γ-干擾素的檢測[QuantiFERON-TB?Gold In Tube (QFT-IT);Cellestis Limited Chadstone, Vic., 澳大利亞]以及周圍血單個(gè)核細(xì)胞的γ-干擾素的檢測(T-SPOT.TB; Oxford Immunotec, Abingdon, 英國)，是一種Mtb感染的細(xì)胞免疫檢查。細(xì)胞免疫在Mtb感染中發(fā)揮主要的作用，當(dāng)機(jī)體感染Mtb時(shí)，巨噬細(xì)胞通過toll-樣受體(Toll- like receptor, TLR)識別Mtb，通過胞吞控制Mtb。同時(shí)巨噬細(xì)胞釋放IL-12，誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN-γ，IFN-γ再刺激巨噬細(xì)胞的胞吞以及對于Mtb的氧化性損傷[22]。IGRAs的敏感度高，因此得到廣泛的關(guān)注。但是研究表明，IGRAs在診斷活動性結(jié)核病中比較結(jié)核菌素試驗(yàn)，并沒有更高的敏感度[23]，不能鑒別結(jié)核病是活動性結(jié)核病還是潛伏性結(jié)核病。在TBM的診斷中，有研究者將其改進(jìn)，直接檢測腦脊液中IGRAs，用于診斷TBM[24]，檢測腦脊液中IFN-γ的表達(dá)可用于TBM的診斷，并取得了令人鼓舞的診斷結(jié)果。雖然其敏感度在不同的研究中報(bào)道不同[25, 26]，并且該項(xiàng)檢測需要腦脊液量大(6～10 ml)，但是其診斷價(jià)值非常值得進(jìn)一步研究。

3.2 體液免疫檢測 包括Mtb抗原檢測和抗體檢測。抗體檢測方法主要用于檢測結(jié)核患者血清中的特異性抗體。目前并沒有取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，沒有研究證據(jù)表明抗體檢測有足夠的靈敏度和特異度，并不能作為結(jié)核病納入或排除的診斷依據(jù)。因此WHO不推薦將結(jié)核抗體檢測作為診斷結(jié)核病依據(jù)[27]。2001年，有研究發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)病患者和Mtb致敏的患者體中的T細(xì)胞可以識別Mtb6 kD早期分泌蛋白 (ESAT-6)和thologue蛋白[28]。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了將Mtb抗原作為結(jié)核病診斷標(biāo)記物的研究，如將MPB-64抗原用于周圍血和尿液標(biāo)本的檢測、ESAT-6抗原用于腦脊液標(biāo)本檢測、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)用于尿標(biāo)本的檢測[29，30]。這些研究都展現(xiàn)出一定的診斷價(jià)值，但是目前尚未廣泛用于臨床。

4 生物化學(xué)檢查

腦脊液生物化學(xué)檢查包括腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme , ACE)等。ADA是用于鑒別TBM與病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎常用的指標(biāo)之一。ADA是一種核酸分解代謝關(guān)鍵酶，在T淋巴細(xì)胞中含量最高。ADA的水平與T細(xì)胞接受Mtb抗原刺激，產(chǎn)生反應(yīng)相關(guān)。很多研究證實(shí)了ADA在TBM診斷中的價(jià)值，但是結(jié)論有矛盾之處, 且敏感度不高。在一項(xiàng)以病原學(xué)確診的TBM患者的研究中，ADA的敏感度為29.9%[31]。腦脊液中臨界值一般定于8 U/L。為了改進(jìn)ADA在TBM診斷中的靈敏度和特異度，不同的研究探討了ADA的臨界值，改進(jìn)了ADA的應(yīng)用，研究的范圍為5.0～15 U/L[32]。不同的臨界值有不同的敏感度和特異度。一項(xiàng)研究提示ADA在1～4 U/L時(shí)，其敏感度>93%，特異度 <80%，可用于排除TBM診斷；ADA在4～8 U/L時(shí)，既不能確診也不能排除TBM；ADA>8 U/L時(shí), 其敏感度<59%，特異度 >96%，可用于確定TBM診斷。根據(jù)ROC曲線分析，ADA理想的臨界值為5.3 U/L (敏感度和特異度均為84%)[33]。

總之，提高TBM的生存率改善預(yù)后的關(guān)鍵是快速診斷和啟動抗結(jié)核治療。在TBM的診斷方面已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，由于TBM是少菌型結(jié)核病，腦脊液中菌量低，限制了一些診斷方法的使用。臨床醫(yī)師仍然要通過臨床檢查、腦脊液檢查、影像學(xué)改變及評分系統(tǒng)綜合判斷。臨床醫(yī)師需要了解各項(xiàng)診斷方法的特征，從而綜合判斷TBM的診斷。