槐葉決明SSR標記開發與應用

劉玉洋，葉生月，閔 會，王慧中*，盧江杰*

(1.杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3.桐廬縣農業產業化辦公室，浙江 桐廬 311500； 4.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052)

決明屬植物全世界約590種，我國原產約10種，中部、東南部、南部及西南部各省區均有分布[1]。入藥用的約19種，具清熱明目、潤腸通便的功效，常用來治療便秘、眼病、皮癬、水腫、高血壓和頭痛等病癥。常見以種子入藥的有小決明(CassiatoraL.)、望江南(C.occidentalisL.)和槐葉決明(C.sopheraL.)等[2]。小決明的種子即最常用的中藥“決明子”，目前廣泛用于治療高血脂癥、高血壓，由于瀉下作用緩和又可降脂，成為減肥用品中的最常用組分之一。望江南在醫藥上常用作緩瀉劑，種子炒后治瘧疾；根有利尿功效；鮮葉搗碎治毒蛇毒蟲咬傷。但有微毒，牲畜誤食過量可以致死，近來關于望江南中毒病例的報道逐漸增多[3]?；比~決明也稱“茳芒決明”，據《中藥大辭典》中記載：“茳芒決明，性平，無毒，味甘滑”。現代醫學研究還表明槐葉決明葉的醇提物有松弛支氣管平滑肌等作用[4-6]。

民間歷來有望江南代替決明使用的情況，而望江南和槐葉決明由于形態相似，也常混用[2]。所以如何區分決明屬不同種是中藥質量研究的熱點之一。宋賢麗等[7]采用高效毛細管電泳對決明屬植物種子中的水溶性成分進行分析，可以較好地區分6種決明屬植物。此外，蒽醌類、黃酮類和萜類等化學成分的化學指紋圖譜被廣泛應用于決明屬植株的研究[8-9]。近年來，DNA分子標記也開始在決明屬植物中得到應用。如王靜等[10]建立了SRAP分子標記體系，可用于決明屬植物的遺傳多樣性和種質鑒定等研究。但是可用的SRAP分子標記數量有限，一定程度上限制了決明屬植物大規模研究工作的開展。隨著高通量測序技術被越來越廣泛地應用于轉錄組分析，通過轉錄組序列開發全基因組SSR分子標記，用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、目標基因定位以及指紋圖譜繪制等研究成為可能[11]。Jain等[12]在沙棘轉錄組中發現7.69%的序列含有SSR位點，而且平均每6.704 kb就有一個SSR位點。Li等[13]通過同色兜蘭3.77 Gb的轉錄組數據，從3 975條含有SSR位點的序列中獲得4 989對SSR引物。Zeng等[14]從箭葉淫羊藿轉錄組序列中隨機選擇32個SSR分子標記進行驗證，其中18對引物可以擴增出條帶。目前決明屬的SSR標記開發尚未見報道，本研究通過分析槐葉決明轉錄組數據，利用生物信息學方法搜尋SSR位點，并設計SSR標記的引物，進而利用SSR標記分析小決明、望江南和槐葉決明等決明屬材料，以期利用開發的決明屬SSR分子標記進行該屬植物的種質鑒定和遺傳多樣性分析等相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為不同地區收集的1份槐葉決明種子、3份望江南種子和5份小決明種子，具體信息見表1。種子發芽后，溫室內正常培養，待植株長到20 cm高后，采集新鮮葉片，液氮冷凍處理后，超低溫保存，用于后續提取DNA。

表1 材料編號名稱與產地

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

DNA提取參考Doyle等[15]的CTAB法，利用超微量紫外分光光度計(NanoUV-3000)進行DNA濃度測定。并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。

1.2.2 轉錄組數據分析和SSR位點引物設計

利用MISA軟件對浙江省藥用植物種質改良和質量控制技術重點實驗室擁有的槐葉決明轉錄組數據進行生物信息學分析，按照軟件默認參數鑒定單堿基重復SSR、雙堿基重復SSR、三堿基重復SSR、四堿基重復SSR、五堿基重復SSR和六堿基重復SSR。

使用軟件Primer Premier 5.0進行引物設計。設計時設置的主要參數為：EST序列長度在150 bp以上；引物長度控制在18～25 bp；避免產生二級結構如dimer，hairpin，falseprimer等；CG含量在40%～70%；退火溫度處于45.0～65.0 ℃；PCR擴增產物的長度在100～300 bp。引物由上海生工公司合成。

1.2.3 SSR分子標記PCR擴增和引物篩選

PCR反應體系(10 μL)如下：10×PCR Buffer 1 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL，10 μmol·L-1的正向和反向引物各0.5 μL，2 U·L-1Taq酶0.5 μL，20 ng·μL-1DNA模板1 μL，ddH2O 6.2 μL。PCR反應程序如下：94 ℃預變性3 min，32個循環(94 ℃變性30 s，各引物退火溫度下復性40 s，72 ℃延伸90 s)，最后72 ℃延伸10 min。選擇2個材料的基因組DNA篩選合成的SSR引物，選出條帶清晰且多態性好的引物用于后續所有材料的PCR擴增。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳和數據分析

將8%丙烯酰胺40 mL，10%過硫酸銨280 μL，TEMED 26 μL，混合均勻后水平灌膠，插上68孔梳子，水平放置直至膠凝固(30 min左右)。在電泳槽中加入適量1×TBE緩沖液，上樣，在200 V電壓下電泳分離2 h。電泳結束后，用蒸餾水將凝膠漂洗2 min后，置入800 mL 0.1%的AgNO3溶液中染色25 min(期間使用搖床搖動)；之后在蒸餾水中漂洗2次，每次10 s。將漂洗之后的凝膠放入含有800 mL 1%的氫氧化鈉溶液中(含2 mL甲醛)顯影，搖床搖動直至凝膠上出現清晰的條帶。用蒸餾水漂洗10 s。

使用BIO-RAD visadoc 3.0(Bio-RAD，USA)成像系統進行凝膠掃描后，通過Quantity One軟件依據DNA Marker計算每個條帶的分子量大小，并依據SSR標記的預計大小和重復單元進行矯正，確定等位變異大小(bp)和數量，由軟件PowerMarker version 3.25[16]進行遺傳豐富度(A)和多態信息量(PIC)等多樣性指數計算。

2 結果與分析

2.1 槐葉決明轉錄組SSR位點分布特點

利用MISA軟件對拼接得到的103 305條槐葉決明unigene進行SSR位點搜索，共檢測到15 753個SSR位點，可用于標記開發。如表2所示，單堿基重復數SSR位點數占39.55%，其中以A/T占比最大(38.51%)；雙堿基重復數占27.40%，其中AG/CT占9.36%；三堿基重復數占30.84%，其中AAG/CTT占9.36%；四堿基重復數占1.44%，其中AAAG/CTTT占0.37%；五堿基重復數占0.23%，其中AAAAG/CTTTT占0.03%；六堿基重復數占0.53%，其中AAGAGG/CCTCTT占0.01%。

2.2 SSR分子標記開發和驗證

對15 753個SSR位點利用Primer Premier 5.0進行引物設計，最終有10 110個SSR位點可以設

表2 槐葉決明轉錄組SSR位點各類型的情況

計SSR引物。隨機選擇50對SSR引物由上海生工合成，通過PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳，銀染，拍照，經初步篩選得到25對條帶清晰、有差異的SSR引物可用于后續不同產地槐葉決明遺傳多樣性分析。這些標記的等位基因數量從2到7不等，平均有2.72個等位基因；遺傳豐富度從0.20到0.73不等，平均為0.45；PIC從0.18到0.70不等，平均為0.39(表3)。圖1為SSR引物CPtSSR008在不同試驗材料中的電泳結果。

表3 本研究中用于遺傳多樣性分析的25對SSR分子標記信息

1～9分別表示本研究中使用的決明屬種質資源材料，與表1相同。M為DNA標準分子量圖1 引物CPtSSR008的電泳結果

2.3 不同決明屬材料的遺傳多樣性分析

根據25對SSR引物電泳結果，通過聚類距離比較分析發現：槐葉決明和不同產地決明子、不同產地決明子之間遺傳距離在0.111～0.963，其中槐葉決明、小決明和望江南各種之間，以及小決明和望江南不同地理來源之間均存在較大遺傳差異(表4)。

進一步通過遺傳聚類分析，我們發現槐葉決明、小決明和望江南可分為三類：槐葉決明為第一類；河北、安徽、北京產地的望江南為第二類；四川、廣西、廣東、甘肅、河南產地的小決明為第三

表4 各材料的遺傳距離

類(圖2)。從種子外觀上看，槐葉決明種子與決明差異較大，這與利用SSR分子標記鑒定的結果一致，而不同產地的槐葉決明和望江南材料無論種子還是植株根莖葉差異都不大，很難從外觀上鑒定出不同，利用SSR分子標記技術，我們鑒定出了槐葉決明和不同產地望江南的差異，從而為槐葉決明和望江南的種質資源分析鑒定提供依據。

圖2 基于SSR分子標記的決明屬遺傳聚類

3 小結與討論

通過分析槐葉決明轉錄組數據，本研究共發掘了15 753個SSR位點，并成功設計出10 110對SSR引物。隨機選取其中的50對SSR引物中，有電泳條帶清晰和多樣性高的SSR引物25對，可用于本實驗室收集的決明屬材料遺傳多樣性分析以及種質資源鑒定。因此，我們預計本研究共開發決明屬SSR標記5 000個左右。而且這些標記可為槐葉決明、小決明和望江南3個種為代表的決明屬材料相關研究提供分子標記數據庫。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M]. 北京：科學出版社, 1988: 125.

[2] 連文琰. 中國決明屬藥用植物簡報[J]. 中草藥, 1986, 17(70): 27.

[3] 韓文雯, 李天祥. 望江南子的生藥學研究[J]. 天津藥學, 2011, 23(3): 49-51.

[4] SINGH R, HUSSAIN S, VERMA R, et al. Anti-mycobacterial screening of five Indian medicinal plants and partial purification of active extracts ofCassiasopheraandUrticadioica[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2013,6(5):366-371.

[5] TIWARI R D, MISRA G. Chemical examination of the flowers ofCassiasophera[J]. Planta Medica, 1975, 28(2): 182-185.

[6] ZHAO Y, LIU J P, LU D, et al. A novel cycloartane triterpene glycoside from the seeds ofCassiasopheraL. [J]. Natural Product Research, 2007, 21(6): 494-499.

[7] 宋賢麗, 郭寶林, 劉克武, 等. 6種決明屬藥用植物種子毛細管電泳法鑒別[J]. 中國中藥雜志, 2003,28(6): 14-19.

[8] 李婷, 馮占民, 楊巡紜, 等. 決明屬植物的化學成分及藥理作用研究進展[J]. 林產化學與工業, 2012, 32(6): 107-118.

[9] 胡勇, 陳麗瓊, 朱霞, 等. 決明屬化學成分與藥理作用研究進展[J]. 現代中藥研究與實踐, 2013, 27(5): 69-71.

[10] 王靜, 張躍進, 梁宗鎖, 等. 決明DNA提取、SRAP-PCR優化及引物篩選[J]. 西北農業學報, 2014, 23(2): 137-142.

[11] KALIA R K, RAI M K, KALIA S, et al. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants [J]. Euphytica, 2011, 177(3): 309-334.

[12] JAIN A, CHAUDHARY S, SHARMA P C. Mining of microsatellites using next generation sequencing of seabuckthorn (HippophaerhamnoidesL.) transcriptome [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants: An International Journal of Functional Plant Biology, 2014, 20(1): 115-123.

[13] LI D M, ZHAO C Y, LIU X R, et al. De novo assembly and characterization of the root transcriptome and development of simple sequence repeat markers inPaphiopedilumconcolor[J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(2): 6189-6201.

[14] ZENG S, XIAO G, GUO J, et al. Development of a EST dataset and characterization of EST-SSRs in a traditional Chinese medicinal plant,Epimediumsagittatum(Sieb. Et Zucc.) Maxim [J]. BMC Genomics, 2010, 11：94.

[15] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochemical Bulletin, 1987, 19(1): 11-15.

[16] LIU K, MUSE S V. PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis [J]. Bioinformatics, 2005, 21(9): 2128-2129.