三紅蜜柚體細胞胚胎的誘導

林亮亮

(福建農業職業技術學院，福建 福清 350119)

琯溪三紅蜜柚系蕓香科柑橘屬柚類優良品種之一，是福建省平和縣地方傳統名果琯溪蜜柚的芽變株中最新選育的優良品種，2012年獲得福建省品種審定委員會認證推廣。三紅蜜柚果肉紅艷，晶瑩透亮，果皮海綿層呈粉色，外果皮黃里透紅，深受消費者喜愛，其柚果果型倒卵圓形，汁胞紅色，富含番茄紅素和β-胡蘿卜素，果汁豐實，甜酸適口，品質極佳，比普通品種琯溪蜜柚、紅肉蜜柚早熟10～15 d，且皮薄少籽，柚果可食率高達70%，有良好的發展前景與市場競爭力[1]。目前，三紅蜜柚主要采用嫁接和實生苗等繁殖方法，生產季節性強，對操作技術要求較高，限制了優良新品種的迅速推廣。

近年來，關于果樹體細胞胚胎再生體系的研究越來越多，并已在蘋果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝等樹種上成功獲得體細胞胚胎[2]。植物體細胞胚胎的發生、發育與合子胚相似，是離體培養形態發生的有效途徑之一[3]。胚狀體的培養材料可采用植物的各種器官、組織做為外植體進行培養，甚至在懸浮細胞培養和原生質體培養中都有可能形成體細胞胚胎，在取材方面比較方便多樣；同時，胚狀體的培養能將植物的無性繁殖從田間移至室內，縮短植物繁殖時間，使育苗工廠化，從而避免傳統繁殖方式受生產季節及技術等瓶頸的影響。因此，運用細胞工程中的體細胞胚胎培養技術進行植物組培快繁，可在較短時間內獲得基因型統一、表現型優良的一致性群體，能夠周年生產不受季節與地理位置的限制，在快速繁殖苗木、制作人工種子及基因工程研究等方面具有較大應用潛力。

本研究采用三紅蜜柚無菌苗中的莖段為外植體誘導胚性愈傷組織形成，進一步分化形成體細胞胚胎，探討不同培養基與植物生長調節劑對誘導三紅蜜柚胚性愈傷組織以及體細胞胚胎形成等關鍵環節的影響，逐步建立起三紅蜜柚體細胞胚胎發生途徑的組培快繁技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自福清市惠煌農業開發有限公司三紅蜜柚綠色生產基地，并由福建農業職業技術學院組培中心利用三紅蜜柚種胚培育出的無菌苗，經增殖形成的叢生苗中選取。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

試驗采用株高4～5 cm，帶4～6片真葉的三紅蜜柚無菌苗為材料，因為材料本身無菌，無需再進行消毒處理，直接在超凈工作臺上將其莖段截成長0.5～1 cm的小段，每段帶1～2個莖節，作為誘導體細胞胚發生的外植體。

1.2.2 培養條件

試驗采用MS、B5和改良WPM為基本培養基，根據不同培養階段添加不同濃度與配比的植物生長調節劑(2，4-D、6-BA和NAA)，所有培養基添加瓊脂7 g·L-1，調節pH值5.6，在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻凝固后使用，培養溫度為(25±2)℃，胚性愈傷組織誘導的光照強度為500～1 000 lx，胚狀體萌發的光照強度為1 000～1 500 lx，壯苗與生根培養的光照強度為1 500～2 000 lx，光照時間12 h·d-1。

1.2.3 胚性愈傷組織的誘導

試驗采用正交設計L9(34)，研究基本培養基(MS、B5、改良WPM)與植物生長調節劑2，4-D(0.5、1、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1) 對三紅蜜柚胚性愈傷組織誘導率的影響。將莖段接種到不同培養基上，每處理接種30瓶，每瓶接1個莖段，重復3次。

1.2.4 胚狀體的誘導

試驗采用正交設計L9(34)，研究基本培養基(MS、B5、改良WPM)與植物生長調節劑6-BA (0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.1、0.5 mg·L-1)對三紅蜜柚胚狀體發生率的影響。從誘導培養的三紅蜜柚胚性愈傷組織中選取出淡黃色、顆粒狀較明顯的愈傷組織塊，接種到不同的體細胞胚誘導培養基上，每處理接種10瓶，每瓶接3塊，重復3次。

1.2.5 芽增殖

當三紅蜜柚胚狀體上萌發出的小苗長度達到2～3 cm時，將其從基部切下，接種于MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1培養基中進行莖芽增殖，培養30 d左右，選取生長健壯的小苗進行生根培養。

1.2.6 生根及移栽

選取生長健壯的無根小苗移到1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1培養基上誘導生根，將生長健壯、具有7片以上真葉的生根苗逐步過渡到自然環境條件下進行栽培。

1.3 數據統計分析

胚性愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的外植體數/外植體總數；

胚狀體誘導率=產生胚狀體的外植體數/外植體總數[4]。

正交試驗結果采用DPS軟件的正交試驗方差分析，方差分析的差異顯著性用最小顯著差數法(LSD)進行平均數的多重比較[5]。

2 結果與分析

2.1 三紅蜜柚體細胞胚胎誘導、分化與植株再生

試驗從已建立的三紅蜜柚組培快繁體系中獲得的無菌苗莖段為外植體，豎直接種在誘導胚性愈傷組織的培養基上，30 d后莖段上端的切口處以及與培養基接觸的莖段基部逐步出現淡黃色、顆粒感較強的愈傷組織團塊，將其轉移到體細胞胚胎誘導培養基上，25 d后這種淡黃色的愈傷組織能進一步形成胚狀體并萌發產生不定芽，通過繼代培養生成三紅蜜柚小苗。

2.2 不同基本培養基與植物生長調節劑配比對胚性愈傷組織誘導的影響

三紅蜜柚無菌苗中獲得莖段作為外植體，經過胚性愈傷組織培養基的誘導，莖段細胞分裂形成胚性愈傷組織，并不斷增殖，30 d后統計胚性愈傷組織誘導率。由表1可知，通過對各處理因子不同水平的SSR檢驗，基本培養基對三紅蜜柚胚性愈傷組織誘導率的影響達到極顯著水平，MS、B5、改良WPM培養基的誘導率均值分別為48.2%、19.3%、4.8%，誘導效果以MS培養基為最好；植物生長調節劑2,4-D、6-BA不同水平對胚性愈傷組織誘導的影響較大，2,4-D濃度1.0和1.5 mg·L-1的誘導率均值分別為31.9%和11.9%，期間極差達20.0百分點；6-BA濃度0.5和1.0 mg·L-1的誘導率均值分別為29.6%和15.2%，其間極差達14.4百分點，均達到極顯著水平。因此，三紅蜜柚莖段胚性愈傷組織誘導的最佳培養基組合為MS+2，4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1。

2.2 不同基本培養基與植物生長調節劑配比對胚狀體發生的影響

將誘導出的三紅蜜柚胚性愈傷組織細胞團接種到體細胞胚胎誘導培養基上，以檢測愈傷組織的體胚發生能力[6]。

不同基本培養基與植物生長調節劑(6-BA、NAA)配比對胚狀體分化的影響見表2。通過對各處理因子不同水平的SSR檢驗，基本培養基對胚狀體分化率的影響達到極顯著水平，以MS為最好，分化率均值達43.3%。在胚狀體分化期間，不同培養基添加不同植物生長調節劑配比表現不同，NAA不同水平對胚狀體發生均表現有抑制作用，并隨著NAA濃度增強，達到極顯著水平；6-BA對胚狀體的發生產生一定影響，6-BA為0.1，1.0 mg·L-1的發生率均值分別為37.0%和14.5%，其間極差達22.4百分點，達到極顯著水平。試驗結果還表明，添加0.1～0.5 mg·L-1的6-BA對胚狀體發生有促進作用。因此，誘導胚狀體發生的最佳培養基為MS+6-BA 0.1 mg·L-1。

表1 不同基本培養基、不同植物生長調節劑配比對胚性愈傷組織的誘導效果

表2 不同基本培養基、不同植物生長調節劑配比對胚狀體的誘導效果及SSR檢驗

3 小結與討論

試驗針對三紅蜜柚體細胞胚胎誘導中的突出問題，以篩選適宜誘導三紅蜜柚胚性愈傷組織與胚狀體的培養基為目的，把優化激素種類配比和濃度做為研究重點。試驗采用前期培養的三紅蜜柚無菌苗莖段為外植體，運用正交試驗設計的研究手段，充分發揮其篩選最佳試驗處理組合的捷徑功能，達到優化培養基配方的目的。

已有研究表明，不同果樹種類對基本培養基的選擇也有物種特異性，必須對不同培養基的誘導效果進行對比，篩選出適合誘導三紅蜜柚的體細胞胚胎生長的培養基，并進一步獲得最佳誘導培養基組成。選用3種具有一定代表性的MS、B5和改良WPM培養基進行誘導表明，MS的誘導效果最佳，B5次之，改良WPM最差，對這3種培養基的成分進行分析，三紅蜜柚胚性愈傷組織與胚狀體的誘導及生長狀況與培養基中銨態氮及充足的鐵離子供給有關。

甜橙馴化愈傷組織生長素對胚胎發生了重要作用[7]。Rao等[8]研究結果也表明2，4-D對體細胞胚胎的發生起促進作用。本試驗結果表明，添加2，4-D 1.0 mg·L-1及6-BA 0.5 mg·L-1的MS培養基誘導胚性愈傷組織的效率最高，該類愈傷組織呈淡黃色，結構緊實顆粒感強，而2，4-D濃度過高則會起到抑制作用，且易造成培養物褐變。在三紅蜜柚胚狀體誘導過程中，隨著NAA濃度升高胚狀體的發生率逐步降低，采用不添加NAA而單獨添加6-BA 0.1 mg·L-1的MS培養基誘導胚狀體發生率最高。

試驗運用細胞工程中體細胞胚胎培養技術進行三紅蜜柚體細胞胚胎誘導，建立三紅蜜柚優良單株的體細胞胚胎再生體系，為三紅蜜柚優良新群體的擴繁與今后的基因工程研究奠定基礎。在后續中還可進一步對體細胞胚胎發生的分子機理及生理生化機制進行研究，把促進體細胞胚胎發生的研究成果在實際生產中進行應用。

[1] 賴鎮國.琯溪蜜柚生態高效栽培技術[J]. 農業與技術，2017，37(11):84-85.

[2] 任海燕，薛曉芳，王永康. 果樹體細胞胚胎發生影響因子研究進展[J]. 山西果樹，2016(4)：19-22.

[3] 魯旭東，蕭浪濤，劉華英. 脫落酸與植物體細胞胚胎發生關系的研究進展[J].生物技術通報，2003(5):19-26.

[4] 黃靖. 金橘體細胞胚胎誘導的研究[J].福建農業學報，2014，29(5)：454-460.

[5] 唐啟義，馮光明. 實用統計分析及DPS數據處理系統[M]. 北京：農業出版社，2002.

[6] 元英進，葛志強. 植物細胞培養工程[M]. 北京：化學工業出版社，2004.

[7] 李浚明.植物組織培養教程[M].2版. 北京：中國農業大學出版社，2003.

[8] RAO P S，HANDRO W，HARADA HOMORNAL H. Control of differentiation of shoots，roots and embryoids in leaf and stem culture ofPetuniaifllataandPetuniahybrida[J]. Phsiol Plant，1973，28：458-463.