納米銀抗菌產品體外細胞毒性測定

張昦昉，王璐茜，盧海霞，姚春濤，王鈞

（吉林省藥品檢驗所，吉林 長春 130033）

引言

納米銀抗菌機制尚不明確，有研究表明：納米銀能夠使酶失活，干擾呼吸代謝；能夠增加細胞膜的通透性[1]；可損傷細菌的DNA[2]。細胞毒性試驗是利用體外細胞培養方法來評價生物材料和醫療器械或浸提液潛在的細胞毒性，細胞毒性試驗是生物安全評價體系中重要的檢測指標之一。本研究采用MTT 法考察樣品的體外細胞毒性，為納米銀抗菌產品的體外安全性評價和標準的制定提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 L929 細胞，購自中國科學院上海細胞生物研究所；DMEM 高糖培養基，HyClone 公司；胎牛血清，GIBCO；MTT，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 儀器 超凈工作臺，蘇凈安泰；二氧化碳培養箱，Thermo；酶標儀，BIO-RAD。

2 實驗方法

2.1 細胞株及培養基 L929 細胞，采用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基培養。

2.2 樣品配制 采用1 號、2 號、3 號、4 號、6 號樣品，其中1 號、4 號、6 號樣品為液體，2 號、3 號樣品為浸膏。1 號、4 號、6 號樣品的配制：取1 號、4 號、6 號樣品，0.25μm 濾膜過濾除菌，即得原液。取適量原液，加入含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基，稀釋至1/5原液、1/10 原液、1/30 原液、1/100 原液、1/300 原液、1/1000 原液。2 號、3 號樣品的配制：稱取適量2 號、3號樣品，加入含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基，制得濃度為0.2 mg/ml 的原液，0.25μm 濾膜過濾除菌。取適量原液，加入含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基，稀釋至1/5 原液、1/10 原液、1/30 原液、1/100 原液、1/300 原液、1/1000 原液。

表1 受試物對體外細胞相對增值率和細胞毒性評級的影響（，d）

表1 受試物對體外細胞相對增值率和細胞毒性評級的影響（，d）

2.3 MTT 試驗 取生長狀態良好的L929 細胞，消化，調整細胞密度，均勻接種到96 孔板內。24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，吸棄培養液，加入受試物100μl，陰性對照組加入完全培養基100μl，繼續培養48 h。48 h 后，每孔加入20μl MTT（5 mg/ml），繼續培養4 h 后，吸棄孔內液，加入DMSO150μl，震蕩10 min，500 nm處測定吸光度值。

3 評價標準

采用細胞相對增值率（relative growth rate,RGR）評價細胞毒性：

0 級為RGR ≥100%，1 級為80%-99%，2 級為50%-79%，3 級為30%-49%，4 級為0-29%

4 結果

4.1 對細胞形態的影響 在倒置顯微鏡下放大200 倍觀察可見，陰性對照孔內細胞形態多成梭形或多邊形，疏松貼壁，無胞漿內顆粒。在不同的受試物中，細胞毒性分為2 級的孔內細胞多數呈梭形或多邊形，部分細胞呈圓形，無胞漿內顆粒，明顯可見細胞溶解和細胞間空區；細胞毒性分級為3 級的孔內細胞多數變圓漂浮、脆核固縮、胞內形成許多空泡，細胞溶解；細胞毒性分級為4 級的孔內細胞大多數呈圓形或溶解，細胞層幾乎完全破壞。

4.2 受試物對體外細胞相對增值率和細胞毒性評級的影響5 種受試物的體外細胞相對增值率和細胞毒性評級結果見表1。結果表明，受試物不同濃度對細胞相對增值率差異較大，當稀釋比為1:100 時，細胞毒性均顯著降低。

5 結論

納米銀具有較廣的抗菌譜，對大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體等均都有抑制和殺滅作用，且不易產生耐藥性。納米銀的抗菌特點被廣泛應用，但其安全性有待于深入研究[3]。本研究表明，受試物不同濃度對細胞相對增值率差異較大，當稀釋比為1:100 時，細胞毒性均顯著降低。