復方紫草油微生物限度檢查法的建立＊

高 媛，劉云云，馬曉昱，張世曉，陳 瑤

復方紫草油是《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》［1］收載的品種，由紫草，金銀花，白芷等藥材加入麻油浸漬，熱提而成，具有清熱解毒，涼血鎮痛的功效。用于燒傷、燙傷、創傷潰瘍及濕疹等癥。本品為非無菌制劑，根據質量標準要求，進行微生物限度檢查，《中國藥典》2015 年版四部［2，3］較 2010 年版在微生物限度檢查方法上有非常顯著改變。本文對復方紫草油進行微生物限度檢查的方法適用性試驗，結果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HK-DC-1200B電子天平（福州華科電子儀器有限公司）；YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司）；11211 BBC86生物安全柜（山東博科生物產業有限公司）；MJX-160B-Z霉菌培養箱 （上海博迅實業有限公司）；XJX-150液晶細菌培養箱 （常州市科邁實驗儀器有限公司）

1.2 培養基和稀釋液 胰酪大豆胨固體培養基（批號：20160120）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基 （批號：20160102）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基 （批號：20160225）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基 （批號：20170322）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下稱稀釋液，批號：20170308），上述培養基均來自北京奧博星生物科技有限責任公司；聚山梨酯80（批號：F20111213）、司盤 80（批號：F20030927）、單硬脂酸甘油酯（批號：20130412）、十四烷酸異丙酯（批號：20151125），上述試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司。培養基的適用性檢查符合相應的《中國藥典》2015年版四部通則的規定。

1.3 試驗菌種 金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63 501］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、銅綠假單胞菌［CCMC（B）10 104］均購于山東省藥檢所；黑曲霉 ［CMCC（F）98 003］為軍委后勤保障部衛生局藥檢所提供；用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

1.4 樣品 復方紫草油（解放軍第159醫院，批號：151111、151210、151227）。

1.5 方 法

1.5.1 菌液的制備［2］按照《中國藥典》2015年版四部要求，接種金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨液體培養基中，33℃培養18 h；接種枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨瓊脂培養基，33℃培養24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中，23℃培養48 h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數不大于1000 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基，23℃培養120 h。用5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子制成孢子懸液，再用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數不大于1000 cfu的孢子懸液。

1.5.2 供試液的制備 取供試品7組，每組各10ml，分別加入：A組：無菌十四烷酸異丙酯5 ml；B組：無菌十四烷酸異丙酯10 ml；C組：無菌十四烷酸異丙酯15 ml；D組：無菌十四烷酸異丙酯20 ml；E組；無菌聚山梨酯80 10 g；F組：十四烷酸異丙酯10 ml和聚山梨酯80 5 g無菌混合物；G組；司盤80 5 g、單硬脂酸甘油酯3 g和聚山梨酯80 10 g無菌混合物；7組分別混勻，再加入稀釋液至100 ml，混勻，靜置。

1.5.3 回收率測定

1.5.3.1 試驗組 取1∶10供試液G組9.9 ml和0.1 ml的試驗菌液，混勻，取1 ml注入平皿中。

1.5.3.2 供試品對照組 取1∶10供試液G組9.9 ml和0.1 ml的稀釋液，混勻，取1 ml注入平皿中。

1.5.3.3 菌液組 取相應稀釋劑替代供試液，加入各試驗菌，使最終菌濃度＜100 cfu/ml。

完成上述步驟，各組平皿分別傾注20 ml培養基搖勻，待凝固后，置藥典規定的條件下培養，計算菌落數，每種試驗菌平行制備2個平皿。

1.5.3.4 回收率的計算 ［（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液組菌落數］×100%，比值應在0.5～2。

1.5.4 控制菌檢查方法適用性試驗

1.5.4.1 試驗組 取1∶10的供試液G組10 ml和金黃色葡萄球菌或銅綠假單孢菌菌液1 ml（含菌量不大于100 cfu），接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養基中。

1.5.4.2 陽性對照組 取金黃色葡萄球菌或銅綠假單孢菌菌液1 ml（含菌量不大于100 cfu），接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養基中。

1.5.4.3 陰性對照組 取無供試品的G組供試液10 ml，接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養基中。

以上各組在33℃培養24 h，分別取培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板或溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，33℃培養72 h。

2 結果

2.1 不同供試液制備方法分析 不同方法制備的復方紫草油供試液呈現不同性狀，結果顯示：A組、B組、C組和D組的供試液溶液分層，上層紅色油狀液，下層水層；E組供試液溶液分層，上、下層均為淡粉色乳狀液；F組供試液溶液分層，上層為淡粉色乳狀液，下層為紅色油狀液；G組供試液溶液為穩定淡粉色乳狀液。

表明以司盤80、單硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80作為中和劑，可以得到均一穩定的供試液。

2.2 復方紫草油對試驗菌株的菌落回收試驗結果

試驗研究表明，使用混合中和劑配制的復方紫草油供試液試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值在0.5-2范圍內，結果見表1。

2.3 控制菌檢查方法適用性 控制菌檢查方法適用性試驗結果見表2。

表1 復方紫草油供試液對試驗菌株菌落回收試驗結果

表2 復方紫草油控制菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

《中國藥典》2015年版四部［2］微生物限度檢查較《中國藥典》2010年版一部［3］有顯著改變。制備穩定的供試液是試驗順利開展的前提條件，油劑作為一種非水溶性的液體制劑，制備性狀穩定的油劑供試品中和劑的使用是不可避免的。《中國藥典》2010年版一部收載制備油劑供試品可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻；《中國藥典》2015年版四部收載制備油脂類供試品，可加入無菌十四烷酸異丙酯［4］，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑。該文按照上述方法制備紫草油供試品，發現無論是單用聚山梨酯80，還是十四烷酸異丙酯都無法得到均一穩定的復方紫草油供試品，導致取樣不均勻；進而使用兩種混合的中和劑，聚山梨酯80加十四烷酸異丙酯，雖然穩定程度有所改善，但仍出現分層現象。為制備穩定的復方紫草油供試品，本研究采用 《中國藥典》2010年版一部需用特殊方法制備供試液的供試品，中和劑選用5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯和10 g聚山梨酯80無菌混合物，發現該混合物可以較好地乳化復方紫草油，得到穩定的乳狀液。以此，首先解決了制備穩定均一供試液的方法。

《中國藥典》2015年版四部在計數方法的適用性試驗中，為了更有效地提高檢出率，對試驗組的制備進行了改進［5-7］，將供試液與試驗菌先混勻再注入平皿，且要求所加菌液的體積不超過供試液體積的1%，所以需將菌液稀釋至少于1000 cfu/ml，取1∶10 供試液 9.9 ml和 0.1 ml（＜1000 cfu）的試驗菌進行試驗。該文發現復方紫草油無抑菌作用，控制菌檢查可采用常規法。

［1］中央軍委后勤保障部衛生局.《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》2015 年版第一冊［S］. 北京：人民軍醫出版社，2016：61-62.

［2］國家藥典委員會編.《中國藥典》2015年版四部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：140-151.

［3］國家藥典委員會編.《中國藥典》2010年版一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.

［4］江志杰，張光華，牛振東.十四烷酸異丙酯在疏水性化妝品微生物檢驗中的應用［J］. 日用化學工業，2012，42（4）：274-276.

［5］鄭小玲，王征南，李 鈺.瑞他莫林軟膏的微生物限度檢查適用性試驗［J］. 中國現代應用藥學，2016，33（5）：634-637.

［6］劉 戈，邱唯佳，費夷敏.替硝唑栓微生物限度檢查方法適用性試驗研究［J］. 上海醫藥，2016，37（13）：73-76.

［7］蘇靜芬.賽霉安乳膏微生物限度檢查方法適用性檢查［J］.海峽藥學，2016，28（8）：81-83.