萬古霉素對大鼠腎小管上皮細胞腎損傷定量評價及其機制研究＊

羅 潔，徐 芬，丁 嵐

(江西醫學高等專科學校檢驗教研室，上饒 33400)

抗生素所導致的中毒性腎損傷在藥物性腎損傷中最常見。萬古霉素自獲得美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準應用于臨床以來，至今仍是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的首選藥物[1，2]，但萬古霉素經靜脈注射給藥后，約25%的ICU患者出現中毒性腎損傷，其副作用尤其是腎毒性常成為限制臨床醫生使用萬古霉素的重要原因[3，4]。有關萬古霉素誘發腎毒性的確切機制尚不完全清楚，本研究旨在就其腎毒性進行體外的定量評價，并就其誘發腎毒性的可能機制進行初步探討，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 萬古霉素溶液的配制 將60mg的萬古霉素（美國Sigma公司）用10ml 0.9%的生理鹽水溶解，配制成濃度為6mg/ml的萬古霉素母液。使用時各取1ml的萬古霉素母液，再分別加入99ml、119ml、149ml、199ml、299ml、599ml的 0.9%生理鹽水各稀釋 600、300、200、150、120、100 倍成濃度為 10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml的工作液。

1.2 大鼠腎小管上皮細胞的培養與分組 健康雄性SD大鼠（180-240g）經水合氯醛麻醉后無菌操作下取其腎組織，去除包膜后分離并剪碎其腎皮質，過篩網獲得腎小管節段，采用0.25%的胰蛋白酶消化并離心獲得單個腎小管上皮細胞，常規培養于完全培養基（DMEM/F12培養基，含10%胎牛血清，1%雙抗，2mmol/L L-谷氨酰胺）中，于37℃、5%CO2下培養2-3d后，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取處于對數生長期細胞（倒置相差顯微鏡下觀察，見圖1所示），按4×105個/ml接種于培養瓶內，每瓶3ml，達80%融合后棄完全培養基，磷酸鹽緩沖液洗2次后再經無血清的DMEM/F12培養基同步靜止24h，給予7個不同濃度組的萬古霉素：0μg/ml組 （空白對照組）、10μg/ml組、20μg/ml組、30μg/ml組、40μg/ml組、50μg/ml組、60μg/ml組。再以20μg/ml組為基礎設立不同的時間組：0h組（空白對照組）、3h 組、6h 組、12h 組、24h 組、48h組，各濃度組均設3瓶細胞。

圖1 培養3d見大量腎小管上皮細胞生長

1.3 乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）釋放百分率與丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量變化將實驗3h后的各濃度組細胞培養上清液轉移至另一96孔板，將細胞裂解液按20μl/孔加入后，37℃裂解細胞45min后，按180μl/孔加入磷酸鹽緩沖液，充分混勻后轉移至另一96孔板中。上清液、裂解液分別于3000r/min下離心10min，取50μl/孔樣品與50μl的LDH底物混合，避光下室溫孵育30min，加入終止反應液50μl/孔，紫外可見分光光度法于490nm處測定吸光度（OD）值。LDH釋放百分率（%）的計算公式如下[3]：

分別于相應培養時間后，收集20μg/ml組的細胞培養上清液，嚴格按照MDA檢測試劑盒（南京建成科技有限公司）說明書測定其中的MDA含量。

1.4 統計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差表示，兩組間的計量資料比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LDH釋放百分率的變化 萬古霉素作用后的細胞培養上清液MDA含量隨著萬古霉素作用濃度的升高而增高。與 0μg/ml組（空白對照組）相比，20μg/ml組、30μg/ml組、40μg/ml組、50μg/ml組和 60μg/ml組的LDH釋放百分率均顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），除 10μg/ml組的細胞 LDH 釋放百分率超過空白對照組釋放百分率（ΔLDH釋放百分率）≤20%外，其余濃度組均超過50%，見表1。

表1 不同濃度組萬古霉素作用后的大鼠腎小管上皮細胞LDH釋放百分率變化s，n=3）

表1 不同濃度組萬古霉素作用后的大鼠腎小管上皮細胞LDH釋放百分率變化s，n=3）

注：與 0μg/ml組（空白對照組）比較，*P＜0.05。

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2.2 MDA含量的變化 萬古霉素作用后的細胞培養上清液MDA含量隨著時間延長而增高。與0h組（空白對照組）相比，24h組和48h組的MDA含量均顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同時間組萬古霉素作用后的細胞培養上清液MDA含量變化（

表2 不同時間組萬古霉素作用后的細胞培養上清液MDA含量變化（

注：與 0h 組（空白對照組）比較，*P＜0.05。

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3 討論

采用腎小管上皮細胞用于研究外源性物質對腎臟的毒性作用早有研究，LDH作為一種胞內酶，其在細胞膜受損時可釋放到細胞外，通過測定腎小管上皮細胞LDH的釋放量并與空白對照組比較可反映出腎小管上皮細胞膜的損傷程度[5]，當細胞LDH釋放百分率超過空白對照組釋放百分率≤20%時，表明細胞輕度損傷，20%-50%時為細胞中度損傷，而當≥50%時，則為細胞重度損傷[6]。萬古霉素在體內主要經腎代謝清除，給藥后24h約90%經人體尿液排除，因此，萬古霉素的腎損傷程度將隨著腎功能變化而變化[7]。本研究結果表明，萬古霉素對大鼠腎小管上皮細胞具有腎毒性，隨著萬古霉素作用濃度的升高，細胞損傷程度逐漸加重，且呈劑量依賴性，當萬古霉素作用濃度≥30μg/ml時，可造成細胞重度損傷狀態。

活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）的大量產生及隨后發生的氧化應激（Oxidative stress，OS）反應是導致肝腎損傷的主要原因之一[8，9]。雖然確切的萬古霉素誘發腎毒性的機制尚不完全清楚，但動物實驗表明，萬古霉素的腎毒性與其損害腎小球并導致近端腎小管發生缺血壞死有關，其具體機制主要因萬古霉素導致腎小管近曲端上皮細胞的氧化應激反應所致[10]。另外有研究表明[11]，近曲小管上皮細胞在萬古霉素的作用下導致氧耗量增加與細胞內線粒體功能改變，此外，腎臟組織中抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等）的基因表達下降，活性氧生成增加，表明氧化應激途徑在萬古霉素誘導腎損傷時被激活[12]。MDA作為細胞脂質過氧化反應的終產物，其含量多少可反映脂質過氧化的程度[13]。本研究結果進一步證實，隨著萬古霉素作用時間的延長，大鼠腎小管上皮細胞的脂質過氧化程度越嚴重，氧化應激損傷可能是萬古霉素致腎損傷的基礎。

綜上所述，本研究結果表明，萬古霉素對大鼠腎小管上皮細胞具有腎毒性，且呈劑量依賴性，其機制可能與氧化應激反應有關。但本研究尚未就調控氧化應激上游的具體分子機制進行闡述，袁嫣等[14]人通過研究Nrf2通路損傷與鈾誘導的大鼠急性腎毒性的相關性，結果提示，急性鈾染毒誘導了大鼠腎組織氧化應激損傷并導致急性腎毒性，而Nrf2通路損傷可能介導了鈾誘導的大鼠急性腎毒性。Jin等[15]的研究表明，五酯片可減輕甚至可能逆轉萬古霉素引起細胞凋亡的程度，其具體分子機制可能通過激活氧化應激信號通路Nrf2/ARE發揮腎損傷的保護作用。因此，Nrf2通路損傷可能與萬古霉素誘導的腎毒性有關，探索Nrf2信號通路對氧化應激應答能力的降低與其腎毒性是否具有相關性尚需進一步的研究證實。

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