炎琥寧對COPD大鼠肺組織IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路影響探討

肖祖克 ，孫 慧 ，葉 東 ，李 星

(1、江西省人民醫院呼吸科，南昌 330006；2、江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 330006；3、江西省永修縣人民醫院，永修 330300)

越來越多的證據表明，IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路在CS引起的肺部炎癥中起著重要的作用[1]。本次研究中，以炎琥寧對COPD大鼠肺組織IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路影響進行研究分析為目的，建立了COPD大鼠模型，并對正常對照組、COPD大鼠組、COPD炎琥寧注射液組大鼠血清以及肺泡灌洗液中的各項指標進行了檢測，并對檢測結果進行了統計分析，結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物雄性SD大鼠，體重在180-220g，級別為SPF。適應性喂養1周后開始實驗。脂多糖購自Sigma公司，批號為L2880；椰樹牌香煙，焦油量為11mg，氯化鈉注射液，購自貴州科倫藥業有限公司，批號為B160623I；變色硅膠，購自青島裕睿化工有限公司，批號為160802；苦味酸為分析純，購自天津市大茂化學試劑廠，批號為160403；水合氯醛購自天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20160305；瑞姬氏染色試劑盒，購自西化儀（北京）科技有限公司，型號為81/M322967；磷酸鹽緩沖液，購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司，批號為NXH0696；自制煙熏箱（亞克力材質）；電子天平購自深圳市華恒科技有限公司，分析天平購自香港佳立國際有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 取大鼠（8周齡，雄性）60只，分為正常組、COPD造模組、COPD造模注射炎琥寧組，每組20只。分組后對各組大鼠進行標記并編號，分組標記后給予各組大鼠同樣的飼料及飲用水。

1.2.2 給藥方法 造模2個月后，開始給予各組分別進行藥物治療，共持續28d。正常對照組：10ml/kg注射用生理鹽水，腹腔注射，每天1次；COPD組：10ml/kg注射用生理鹽水，腹腔注射，每天1次；炎琥寧組：炎琥寧36mg/kg，腹腔注射，每天1次。

1.2.3 取材 肺泡灌洗液的采集：腹主動脈采血后，剪開大鼠的頸部皮膚，暴露頸部器官，打開胸腔，剝離覆蓋肺組織的胸腺和心包，然后找到氣管分支，結扎右主支氣管，用0.9%的無菌生理鹽水6ml，經氣管注入左主支氣管及左肺，反復慢慢回抽4次，回抽液大約 4-5ml，回收率 70%-80%，于 4℃，3000r/min 下離心10min，吸取上清液，置于2ml冷凍管中，-80℃超低溫冰箱保存。肺泡灌洗液離心后所得的細胞沉淀用1ml滅菌的PBS重懸后，保存于2ml冷凍管中，4℃冰箱中保存，用于白細胞計數與分類計數。肺組織固定方法：結扎左肺，松開右肺，經氣管注入4%的多聚甲酸溶液5ml，固定30s，取出右肺中葉，于4%的多聚甲酸中保存，用于HE染色。

1.2.4 檢測方法 冰箱中取出大鼠血清、BALF上清液，放至室溫，嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書進行大鼠血清和 BALF 中 IFN-γ，IL-12，IL-12R，IL-4，IL-4R水平檢測。

1.3 數據處理 采取SPSS 18.0統計學軟件進行數據處理，計量資料經（x±s）形式表示，統計分析采取t檢查，計數資料統計分析采取χ2檢驗，P＜0.05時，視為差異存在統計學意義。

2 結果

COPD大鼠組IL-4R、IL-4水平較正常對照組發生顯著降低 （P＜0.05），IFN-γ、IL-12、IL-12R 水平較正常對照組發生明顯升高（P＜0.05）；COPD炎琥寧注射液組大鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、IL-12R水平較COPD大鼠組發生明顯降低（P＜0.05），IL-4、IL-4R 水平較 COPD 大鼠組發生明顯升高（P＜0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠血清以及肺泡灌洗液中IFN-γ檢測結果比較

3 討論

STAT是一種新型的轉錄因子家族，主要負責連接胞外細胞因子與Th分化轉錄因子之間的胞內信號傳遞[2]。在Th0細胞分化為Th1細胞和Th2細胞的過程中，一種細胞因子在信號轉導中對STAT分子的選擇具有一定特異性，IL-4激活STAT6誘導Th2分化，IL-12激活STAT4誘導 Th1分化[3]。STAT4是決定Th1細胞因子作用的關鍵信號因子，其信號途徑由IL-12激活，可以誘導Th1效應因子IFN-γ的轉錄和表達。STAT6信號途徑依賴IL-4誘導，其在Th2細胞基因表達及發育上發揮重大作用。因此可見，通過IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路活化和誘導的Th1、Th2細胞分化，可直接影響COPD氣道炎癥及病理改變的發生發展[4]。

炎琥寧系穿心連提取物經酯化、脫水、成鹽精制而成，具有抗炎、滅菌的作用。本實驗我們假設，炎琥寧IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路對抗CS對COPD大鼠肺部的免疫失衡，從而對延緩肺泡上皮細胞的炎癥反應和氧化應激，達到保護肺部的作用[5]。

本研究通過建立COPD大鼠模型，設置正常組、COPD大鼠組及炎琥寧注射液COPD大鼠組，檢測各組大鼠血清、肺泡灌洗液中細胞因子IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R 水平，并提取大鼠肺組織， 檢測STAT4、STAT6蛋白水平，及STAT4mRNA、STAT6mRNA的表達情況[6]。實驗研究顯示， 各組大鼠在 IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R、STAT4、STAT6蛋白水平存在差異，由此證實，炎琥寧可通過IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路影響COPD疾病進展。

表2 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-12、IL-12R檢測結果比較

表2 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-12、IL-12R檢測結果比較

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表3 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IL-4R檢測結果比較（

表3 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IL-4R檢測結果比較（

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[1]顧峰.中西醫結合療法治療慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭臨床療效及安全性的Meta分析[J].中國實用醫藥，2013，11(8)：14-15.

[2]中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組，COPD診斷遵照慢性阻塞性肺疾病診治指南 (2013年修訂版)[S].全科醫學臨床與教育，2013，9(11)：484-491.

[3]柳濤，蔡柏薔.慢性阻塞性肺疾病診斷、處理和預防全球策略(2011年修訂版)介紹[J].中國呼吸與危重監護雜志，2012，1(11)：1-12.

[4]劉領，趙淑敏，楊霽，等.COPD患者Th1/Th2平衡失調臨床觀察[J].臨床肺科雜志，2011，16(9)：1335-1336.

[5]徐永芳，陳剛，徐長青.穿心蓮內酯對內毒素誘導急性肺損傷大鼠TLR4、CD14、MD2 mRNA表達的影響 [J].中華中醫藥學刊，2015，33(5)：1198-1200，1290.

[6]王愛華，李全新.IL-2、IL-4、IL-6和IL-8在慢性阻塞性肺部疾病發病中作用的初探[J].江西醫藥，2000，35(2)：72-73.