體外熱處理精子對精子關鍵基因表達的影響＊

巢時斌，吳成亮，張 杰，蘇占榮，辜 敏

(江西省九江市婦幼保健院，九江 332000)

獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），它是被人類免疫缺陷病毒 （HIV）所感染引起的性傳播疾病。HIV病毒是一種對熱非常敏感的病毒，在56℃中30min就被完全滅活[1，2]。本項目組提出一種假說，以精子的熱耐受性理論為基礎，建立一種體外精子熱處理程序。在完全滅活精子HIV的情況下，采用單精子卵胞漿內注射技術，聯合卵子激活，重建精子的受精功能。達到完全阻斷經精子垂直傳播HIV的目的。因此切斷精子垂直傳播HIV研究更加迫切。本項目研究目的是可以提供一種醫療干預手段，從而可以徹底阻斷通過精子垂直傳播 HIV的途徑。此外，這種手段的建立不僅可以應用在防止精子傳播HIV上，也適用于防治其他不耐熱病原體，如丙肝病毒和梅毒螺旋體等通過精子的垂直傳播。

1 材料和方法

4℃，10000rpm/min離心10min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1-2h，后濕法轉膜30-50min。一抗鼠單克隆抗體βactin（1/2000）、兔單克隆抗體 Nrf2（1/1000）溶液孵育，4℃過夜；二抗羊抗鼠 IgG（1/2000）溶液中室溫孵育1-2h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。

1.3 統計學分析 所有數據均用SPSS 20.0統計分析，用表示，經t檢驗顯著性差異，以P＜0.05作為顯著性差異。

圖1 各組熱應激蛋白質HSP70的表達情況（*P＜0.05）

1.1 實驗動物與分組 清潔級BALB/c小鼠。⑴37℃ 30min（陰性對照）；⑵42℃ 30min（一般細胞熱處理）；⑶56℃ 30min（病毒滅活條件）；64℃ 30min（精子高溫處理）；然后以上4個大組又分為以下3個小組：受熱后恢復0min、受熱后恢復1h、受熱后恢復4h。

1.2 方法 取各組進行RNA的提取，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，操作體系

RNase Free dH20 9.5μl

cDNA/DNA 1μl

上游引物 1μl

下游引物 1μl

2xULtraSYBR Mixture 12.5μl

反應程序，三步法：

步驟 溫度 時間

預變性 95℃ 10min

變性 95℃ 10s

退火 56℃ 30s

延伸 72℃ 30s

循環 40

融解曲線分析

95℃ 15s

56℃ 1min

95℃ 15s

56℃ 15s

56℃ 15s

95℃ 0.5℃

計算相對表達量

△△Ct=△Ct試驗-△Ct對照

相對表達量=2-△△Ct

算出各組組織中HSP70、HSP90和DDB1的相對表達量。引物序列如下：HSP70：

F：AGCAGACGCAGACCTTCAC R：TACACCTGGA TCAGCACCC HSP90：F：GACCCTTCTAAGTTGGA CAGCR：CAGACGACTCCCAGGCATADDB1：F：CTGCCACCACTGATGAGGA R：CCCACGCTTTTG ATGACC 內參 GAPDH F：CCTCGTCCCGTAGACA AAA R：TCGCTCCTGGAAGATGG

取各組加入裂解液，放冰上裂解30min后，

2 結果

2.1 熱應激蛋白質HSP70的表達 如圖1所示，熱應激蛋白質HSP70隨著受熱溫度的升高表達而升高，與陰性對照組相比，其他溫度組差異具有統計學意義（P＜0.05）。在64℃受熱后，隨著恢復時間的延長表達也隨之升高，與恢復0min相比，1h和4h的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。在恢復4h時表達最高。

2.2 熱應激蛋白質HSP90的表達 如圖2所示，熱應激蛋白質HSP90隨著受熱溫度的升高表達而升高，與陰性對照組相比，其他溫度組差異具有統計學意義（P＜0.05）。在64℃受熱后，隨著恢復時間的延長表達也隨之升高，與恢復0min相比，1h和4h的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。在恢復4h時表達最高。

2.3 基因修復功能基因DDB1的表達 如圖3所示，基因修復功能基因DDB1在64℃受熱后恢復4h表達最高，與陰性對照組相比，基因修復功能基因DDB11h隨著受熱的溫度升高和恢復時間的延長而表達升高；并且與陰性對照組相比，64℃處理后再恢復4h組差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組熱應激蛋白質HSP90的表達情況（*P＜0.05）

圖3 各組熱應激蛋白質DDB1的表達情況（*P＜0.05）

3 討論

在世界范圍內，艾滋病的防治形勢依然嚴峻。2012年，全世界HIV感染已經達到3400萬[3]。2011年聯合國艾滋病防治曙提出 “Zero new HIV infections”的口號。這需要各個方面的一起努力，防止HIV病毒的傳播。不論在世界范圍內還是中國，HIV的傳播都出現一些新的情況，一個重要的趨勢是HIV在男同性戀之間的傳播增加，直接導致男性艾滋病患者的增加。因此切斷通過精子垂直傳播HIV研究有更加迫切的需要。HSP70是分子量約70kD的熱休克蛋白，是熱休克蛋白家族中組重要的一員，被稱為主要熱休克蛋白。通常情況下分子量為70KD的熱休克蛋白在正常細胞中表達水平會比較低，但是如果處在應激狀態下該蛋白可以明顯升高。在正常情況下HSP70是位于胞漿內，當受到熱休克刺激時，核內HSP70迅速增加[4，5]。因此本研究利用不同溫度處理精子后再用不同時間恢復，結果發現熱應激信號通路開始運行，在半小時的熱處理結束時，已經可以檢測出HSP70表達上調，之后細胞回到正常培養條件，HSP70表達上調依然會持續一段時間。在真核生物體內DDB1的表達是高度保守的，如人的DDB1和小鼠的DDB1氨基酸序列一致性達到99.5%[6]。當細胞受到刺激后，細胞內DDB2受到誘導而累計，并且會將DDB1轉運至細胞核[7]。在動物和人的細胞中，CUL4-DDB1復合體參與DNA的損傷修復，調節基因的轉錄，調控基因組的復制[8]。本研究結果發現，DDB1的表達在高溫處理后表達會下降，隨著正常處理后該基因的表達會升高。這結果說明受熱處理后再恢復正常培養后能夠運行自我修復功能。本結果對ROS（ROS，活性氧自由基，DNA損傷一大原因）檢測結果，精子在熱處理結束后檢測到ROS含量上升，而ROS含量在精子剛回到正常培養條件后再過一段時間才會下降。這個實驗在回復正常培養條件后設置了多個檢測時間點，如果受較高溫度熱處理的精子 （如56℃組），HSP70表達量接近甚至高于受正常熱處理的精子 （42℃組）或者在正常培養條件下HSP70表達量峰值接近甚至高于受正常熱處理的精子（42℃組），而ROS積累量也最終降低。

綜上所述，精子在高溫處理后能夠運行自我修復功能，在正常培養恢復一段時間后一般能夠完成自我修復的精子恢復到了健康的狀態。

[1]Charm SE，Landau S，Williams B，Horowitz B，Prince AM，Pascual D：High-temperature short-time heat inactivation of HIV and other viruses in human blood plasma[J].Vox Sang 1992，62(1)：12-20.

[2]付俊，龔正華，廖清華.江西省2013年男男性作為人群艾滋病感染率及相關高危作為現況分析[J].江西醫藥，2014，49(10)：969-972.

[3]Sholeye OO，Omotosho TJ，Kuponiyi OT，Abosede AO：Safeguarding the health of the Nigerian worker：the role of a workplace HIV/AIDS policy[J].Niger J Med，2012，21(2)：134-137.

[4]Multhoff G，Pockley AG，Schmid TE，et al.The role of heat shock protein 70(Hsp70)in radiation-induced immunomodulation[J].Cancer Letters，2015，368(2)：179-84.

[5]朱林波，付春瑜，李曄，等.腫瘤熱休克蛋白70聯合靈芝孢子粉對荷瘤小鼠的治療作用[J].江西醫藥，2011，46(9)：795-798.

[6]Wu Y，Zhou X，Barnes CO，et al.The DDB1-DCAF1-Vpr-UNG2 crystal structure reveals how HIV-1 Vpr steers human UNG2 toward destruction[J].Nature Structural&Molecular Biology，2016，23(10)：933.

[7]Gao J，Buckley SM，Cimmino L，et al.The CUL4-DDB1 ubiquitin ligase complex controls adult and embryonic stem cell differentiation and homeostasis[J].Elife，2015，4.

[8]Chen YA，Peng YJ，Hu MC，et al.The Cullin 4A/B-DDB1-Cereblon E3 Ubiquitin Ligase Complex Mediates the Degradation of CLC-1 Chloride Channels[J].Scientific Reports，2015，5：10667.