酸性蛋白酶在小麥淀粉乳酒母培養(yǎng)中的應(yīng)用

方頌平，梁臣臣，田啟梅，程抱奎，戚春江，周鵬磊，郭文杰

（安徽瑞福祥食品有限公司，安徽亳州 236800）

酒母培養(yǎng)是酒精發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)，酒精發(fā)酵過程中酒母培養(yǎng)的好壞，直接影響酒精出酒率。以玉米、木薯、糖蜜等為原料生產(chǎn)酒精[1]，酒母培養(yǎng)通常要求外觀糖度在10°Bx左右，培養(yǎng)過程中需添加尿素、磷酸二氫鉀等無機(jī)鹽，促進(jìn)酒母生長(zhǎng)繁殖。以小麥粉提取谷朊粉后的淀粉乳生產(chǎn)酒精[2]，淀粉乳中含有大量水溶性蛋白，在酒母培養(yǎng)過程中添加酸性蛋白酶，將部分水溶性蛋白分解為酵母可利用的短肽、氨基酸等有機(jī)氮源[3-4]，為酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可少用或不用營(yíng)養(yǎng)鹽，減輕酒精廢水COD和磷的處理負(fù)荷[5]；此外，傳統(tǒng)原料酒母培養(yǎng)要求外觀糖度在10°Bx左右，本試驗(yàn)通過不稀釋糖化醪進(jìn)行酒母培養(yǎng)，提高了發(fā)酵醪的酒精度，降低了酒精生產(chǎn)的能耗成本。

本試驗(yàn)以小麥淀粉乳為原料，研究小麥酒精生產(chǎn)過程中不稀釋酒母培養(yǎng)工藝，通過調(diào)節(jié)pH值和添加酸性蛋白酶的方式，達(dá)到酒精生產(chǎn)所要求的酒母培養(yǎng)質(zhì)量要求，為小麥酒精工藝優(yōu)化和節(jié)能降耗提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥淀粉乳，安徽瑞福祥食品有限公司；淀粉酶100000 U/g，杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司；糖化酶200000 U/g，杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司；酸性蛋白酶100000 U/g，杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司；耐高溫釀酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；硫酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：顯微鏡（BX41 OLYMPUS）；恒溫?fù)u床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；40 m3酒母培養(yǎng)罐。

1.2 檢驗(yàn)方法

鏡檢：采用血球計(jì)數(shù)板和次甲基藍(lán)染色法，測(cè)定酒母醪中的酒母細(xì)胞數(shù)、出芽率和死亡率。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糖化醪的制備

取谷朊粉車間A/B混合淀粉乳，固形物濃度在20%左右，加一定量的耐高溫α-淀粉酶，水浴鍋煮沸，液化60 min，降溫至60℃，添加糖化酶，60℃糖化40 min，降溫至30℃，即可。

1.3.2 試驗(yàn)室培養(yǎng)酒母

取100 mL糖化醪置于500 mL三角瓶?jī)?nèi)，加入干酵母，按不同試驗(yàn)條件，在恒溫?fù)u床進(jìn)行酒母培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間6 h，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min。

1.3.3 車間40 m3酒母罐循環(huán)培養(yǎng)酒母

酒母罐滅菌后，注入車間制備的糖化醪，加入復(fù)活后的酵母，按不同試驗(yàn)條件，通入空氣，開啟攪拌，溫度控制在30℃，第一罐培養(yǎng)10 h，此后每罐培養(yǎng)8 h，計(jì)數(shù)酵母，每次培養(yǎng)結(jié)束后放出2/3酒母醪，重新補(bǔ)足糖化醪和酸性蛋白酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)酒母培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)中，對(duì)照組使用稀釋后的糖化醪，營(yíng)養(yǎng)鹽為尿素和磷酸二氫鉀，添加量為0.025 g和0.0125 g；試驗(yàn)組采用不稀釋糖化醪，酸性蛋白酶添加量為0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L，培養(yǎng)結(jié)果見表1。

表1 不同營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)結(jié)果

酒精發(fā)酵的主體是酵母菌，強(qiáng)壯的酵母細(xì)胞可耐受更高濃度醪液和酒精，試驗(yàn)中通過檢測(cè)酵母生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)添加酸性蛋白酶，對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖有明顯的促進(jìn)作用。

由表1可以看出，在不稀釋的糖化醪中加入酸性蛋白酶可顯著提高酒母細(xì)胞數(shù)和出芽率，同時(shí)死亡率顯著下降。當(dāng)酸性蛋白酶添加量為5 mg/L時(shí)，酵母細(xì)胞數(shù)已超過無機(jī)鹽的1.5倍，這表明酸性蛋白酶加入到小麥淀粉糖化醪中起到了預(yù)期的效果，酸性蛋白酶可替代無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行不稀釋酒母培養(yǎng)。由于小麥淀粉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貧乏，僅依靠添加無機(jī)鹽并不能完全提供酒母生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)，而小麥淀粉乳中含有大量的水溶性蛋白，這部分蛋白不能直接為酵母細(xì)胞利用，通過加入酸性蛋白酶，將水溶性蛋白分解為酵母細(xì)胞可利用的游離氨基酸，為其生長(zhǎng)提供豐富的有機(jī)氮源，可促進(jìn)其代謝與繁殖。

圖1 不同酸性蛋白酶添加量對(duì)酵母細(xì)胞數(shù)和出芽率的影響

由圖1可知，隨著酸性蛋白酶用量的增加，酒母細(xì)胞數(shù)和出芽率均增長(zhǎng)，但在添加量達(dá)到10 mg/L后，兩者都未再出現(xiàn)明顯的增加。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，酸性蛋白酶的適宜添加量為10 mg/L。

2.2 不同pH值對(duì)不稀釋醪酒母培養(yǎng)的影響

由于酵母細(xì)胞對(duì)pH值要求較為嚴(yán)格，pH值過高或過低都會(huì)影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，醪液中的pH值會(huì)影響酸性蛋白酶的使用效果，進(jìn)而影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。小麥淀粉乳由于加工工藝較長(zhǎng)，淀粉乳pH值在5.0左右，因此有必要研究不同pH值下，酸性蛋白酶對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響。

本試驗(yàn)中，酸性蛋白酶添加為10 mg/L，調(diào)節(jié)糖化醪初始pH值分別為3、4、5、6、7，培養(yǎng)結(jié)果見表2和圖2。

表2 pH值對(duì)酸性蛋白酶培養(yǎng)酒母的影響

圖2 不同初始pH值對(duì)酵母細(xì)胞數(shù)和出芽率的影響

pH值對(duì)不稀釋酵母培養(yǎng)的影響結(jié)果見圖2。由圖2可看出，在一定pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，酵母細(xì)胞數(shù)和出芽率逐漸增加，在pH6.0時(shí)，分別達(dá)到最大值1.38×108個(gè)/mL和15.2%，而后下降。由此可以得出，不稀釋酒母培養(yǎng)的最佳pH值為6.0。pH值過低或過高，影響糖化醪中液化酶和糖化酶的使用效果，酵母營(yíng)養(yǎng)不良，影響培養(yǎng)質(zhì)量。

2.3 酸性蛋白酶對(duì)不稀釋醪酒母培養(yǎng)大生產(chǎn)試驗(yàn)

為檢驗(yàn)酸性蛋白酶的實(shí)際應(yīng)用效果，以試驗(yàn)確定的酸性蛋白酶使用量和pH值，進(jìn)行生產(chǎn)性酒母罐培養(yǎng)酒母試驗(yàn)。

在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組采用不稀釋糖化醪，調(diào)節(jié)pH值6.0，添加酸性蛋白酶10 mg/L；對(duì)照組采用稀釋糖化醪，不調(diào)pH值，營(yíng)養(yǎng)鹽為尿素和磷酸二氫鉀，培養(yǎng)結(jié)果見表3。

表3 車間大酒母罐培養(yǎng)結(jié)果

從表3可以看出，試驗(yàn)組添加酸性蛋白酶進(jìn)行酒母培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞數(shù)、出芽率和死亡率均明顯優(yōu)于對(duì)照組，酵母細(xì)胞數(shù)平均可達(dá)到對(duì)照組的2倍。此外，試驗(yàn)組傳代11次時(shí)，細(xì)胞數(shù)依然達(dá)2.3×108個(gè)/mL，而傳統(tǒng)稀醪無機(jī)鹽僅培養(yǎng)7代，細(xì)胞數(shù)就近乎為零。表明在不稀釋醪中加入酸性蛋白酶培養(yǎng)酒母具有更好的效果。

3 結(jié)論

3.1 以小麥粉提取谷朊粉后的淀粉乳生產(chǎn)酒精酒母培養(yǎng)中，添加無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽不能完全滿足酵母的生長(zhǎng)需要，而酸性蛋白酶可使小麥淀粉乳中水溶性蛋白分解為酵母細(xì)胞可直接利用的短肽和α-氨基氮，可為酵母提供豐富的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源，并顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)與繁殖。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果表明，使用酸性蛋白酶對(duì)不稀釋糖化醪進(jìn)行酒母培養(yǎng)，培養(yǎng)的最佳pH值為6.0，酸性蛋白酶適宜用量為10 mg/L。通過試驗(yàn)表明，可顯著提高細(xì)胞數(shù)和出芽率，并且延長(zhǎng)酒母?jìng)鞔螖?shù)，這不僅可節(jié)約干酵母的使用量，對(duì)企業(yè)生產(chǎn)上節(jié)能降耗等方面也有一定的指導(dǎo)意義。

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