胃液長鏈非編碼RNA RMRP的檢測及其臨床價值分析

周善學 朱春霞 陸蓉丹 邵永富 葉國良

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是 一類轉錄本長度＞200個核苷酸并且不具備蛋白質編碼功能的RNA分子。LncRNA以RNA的形式在表觀遺傳學水平、轉錄水平和轉錄后水平等多個層面調控基因的表達，是重要的基因表達調控元件[1-2]，參與染色質重構、細胞分化、蛋白轉運、mRNA選擇性剪切等過程[3-4]。在前期研究中，本課題組采用芯片分析了胃癌lncRNA表達譜的差異，發現線粒體RNA處理核糖核酸內切酶RNA組份（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP）在胃癌組織中表達水平顯著改變。本研究擬在前期研究的基礎上，進一步檢測RMRP在不同患者胃液中的水平及變化規律，結合臨床病理因素探討胃液RMRP作為胃癌篩查標志物的臨床價值，并通過聯合比較檢測胃液RMRP、癌胚抗原（CEA）和血清CEA在早期胃癌和進展期胃癌中的陽性率，以期為胃癌早期篩查提供新思路。

1 材料和方法

1.1 標本來源 45例正常或輕度胃炎患者胃液、30例胃潰瘍患者胃液、16例慢性萎縮性胃炎患者胃液和39例胃癌（7例早期胃癌、32例進展期胃癌）患者胃液標本取自2012年9月至2015年1月在本院進行胃鏡檢查的患者，且均經病理檢查證實。所有患者胃鏡檢查前均空腹8h，檢查前2周內未接受任何藥物治療。上述新鮮胃液標本采集后保存在-80℃冰箱中備用。腫瘤病理類型參照WHO的胃癌病理學分類標準，并根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）進行TNM分期。本研究經寧波大學醫學研究倫理道德委員會批準和患者知情同意。

1.2 總RNA的提取 經Trizol LS試劑（美國Invitrogen公司）抽提胃液總RNA，DEPC水復溶后，用核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度，根據總RNA A260/A280比值和1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳RNA條帶完整性鑒定總RNA質量。取10μl總RNA加入GoScript逆轉錄試劑盒（美國Promega公司）進行逆轉錄反應，得到cDNA溶液，加80μl DEPC稀釋后，保存于-20℃冰箱。

1.3 胃液RMRP檢測 采用miScript SYBR Green PCR檢測試劑盒（德國Qiagen公司）對上步的5μl cDNA溶液進行qRT-PCR（美國Stratagene公司），內參GAPDH mRNA引物序列如下：上游為5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游為 5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′；RMRP引物序列如下：上游為5′-ACTCCAAAGTCCGCCAAGA-3′，下游為 5′-TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系為：1μl RMRP特異性擴增上下游引物或GAPDH上下游引物，12.5μl Go-Taq?qPCR Master Mix，5.5μl無 RNase水和 5μl cDNA。qRT-PCR反應條件為：95℃預變性5min；然后94℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45個循環。所有樣本做3個復孔。通過對胃液RMRP的PCR產物克隆測序明確了胃液RMRP的存在，采用qRT-PCR檢測胃液RMRP的特異性。本研究采用ΔCt法分析目的RMRP的相對表達水平。ΔCt=CtRMRP-CtGAPDH。ΔCt數值越大，則基因表達水平越低。

1.4 胃液和血清CEA水平檢測 采用ELISA法檢測胃液和血清CEA水平。所有操作過程嚴格按照CEA定量檢測試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）說明書進行。本研究中胃液和血清CEA定量檢測＞10ng/ml視為陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料組間比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗。繪圖由GraphPad Prism v5.0軟件完成。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常或輕度胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平比較 相對于正常或輕度胃炎患者，胃潰瘍患者胃液RMRP水平無明顯變化（P＞0.05），而慢性萎縮性胃炎患者胃液RMRP水平明顯降低，胃癌患者胃液RMRP水平顯著升高（均P＜0.01），見表1。

表1 正常或輕度胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平比較

2.2 胃液RMRP水平與胃癌患者臨床病理因素關系分析 胃癌患者胃液RMRP水平與患者年齡、幽門螺桿菌感染情況均有關（均P＜0.05），而與性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤位置、血清CEA水平、糖類抗原（CA）19-9水平等因素均無關（均P＞0.05），見表2。同時，筆者構建了胃液RMRP的ROC曲線，AUC為0.699；當其截斷值為-0.592時，胃液RMRP的靈敏度和特異度分別為0.56 和 0.75，見圖 1。

2.3 不同標志物篩查早期胃癌和進展期胃癌的陽性率比較 通過聯合檢測血清或胃液CEA和胃液RMRP，筆者分別檢測了7例早期胃癌和32例進展期胃癌的陽性率。結果顯示，胃液RMRP聯合血清或胃液CEA篩查胃癌的效果明顯優于傳統腫瘤標志物血清CEA（均P＜0.05），見表 3。

表2 胃液RMRP水平與胃癌患者臨床病理因素分析

3 討論

圖1 胃液RMRP水平診斷胃癌的ROC曲線

胃癌是世界上最常見的腫瘤之一，占腫瘤死亡原因的第3位，每年死于胃癌的人數約占全球死亡人數的10.4%[5]。因胃癌的發生、發展是一個多因素、多階段、多步驟的過程，涉及到大量的基因參與及復雜的網絡調控，胃癌的病理生理機制迄今尚未完全闡明，其早期診斷及治療受到極大的限制[6]。研究表明lncRNA參與胃癌的發生、發展過程，并通過復雜的分子機制對胃癌的侵襲和遷移起著極為重要的作用[7-8]。

RMRP定位于人類染色體9p13.3，全長277個核苷酸，由10個不同的亞基及單個RNA分子組成[9-10]。研究發現，RMRP絕大部分存在于細胞核與核仁，仍有小部分存在于線粒體內，可在小鼠及人類組織中表達[11-12]。在線粒體內，RMRP充當核酸內切酶角色，能夠劈開一段從DNA復制起始點合成的RNA產生一條RNA引物，供線粒體DNA領頭鏈合成用。而在核仁，RMRP通過劈開5.8S rRNA前體上最后的短RNA片段，產生成熟的功能性5.8S rRNA分子[13]。此外，RMRP還能與端粒酶相關逆轉錄酶形成復合物而展示出RNA依賴的RNA活性[14]。

RMRP在核糖體合成、細胞周期調控和線粒體DNA的復制中均發揮一定的作用[9]。在腫瘤領域，研究發現RMRP的異常表達可導致腫瘤的發生。Shao等[6]發現胃組織RMRP表達水平只在胃癌前病變階段和胃癌階段顯著降低，顯示它是胃癌相關性lncRNA。Meng等[15]發現RMRP在肺腺癌組織中高表達，其過表達可促進細胞增殖、克隆形成和侵襲，通過調控miR-26發揮致癌活性。Park等[9]研究發現RMRP在許多惡性腫瘤細胞及結直腸癌組織、乳腺癌組織中高表達。由此可見，RMRP是一個潛在的腫瘤檢測及診治新靶點。

本課題組通過lncRNA芯片檢測了胃癌組織及其配對癌旁組織lncRNA表達譜的差異[16]，發現RMRP熒光強度大、差異倍數高，在組織中的變化趨勢一致，以此作為研究對象，檢測其在胃液中的表達水平，探究其臨床意義。本實驗通過qRT-PCR驗證130例患者胃液中RMRP的實際表達情況，發現相對于正常或輕度胃炎患者，胃潰瘍患者胃液RMRP水平無明顯變化，而慢性萎縮性胃炎患者胃液RMRP水平顯著降低，胃癌患者胃液RMRP水平顯著升高，證實了RMRP與胃癌的相關性，具有作為胃癌篩查標志物的潛質。本課題組前期研究發現胃組織RMRP表達水平只在胃癌前病變階段和胃癌階段顯著降低[6]，而胃液RMRP水平在胃癌患者中卻反常性顯著升高。由此推測，胃黏膜細胞癌變時細胞RMRP主動分泌加強，而檢測胃液RMRP水平可進一步提高胃癌檢出率。

表3 不同標志物篩查早期胃癌和進展期胃癌的陽性率比較[例（%）]

幽門螺桿菌感染是引起胃癌進展的主要原因，與宿主炎癥因子密切相關，在這一過程中，微環境的改變可能導致胃癌細胞發生隨機突變，從而導致胃癌的發生[17-18]。結合胃癌患者臨床病理因素，進一步發現了RMRP水平與患者年齡、幽門螺桿菌感染密切相關。由此推測，RMRP可能在胃癌的起始階段發揮炎癥作用，通過以RNA的形式在表觀遺傳學水平、轉錄水平和轉錄后水平等多個層面調控基因的表達進一步促進胃癌的發生。

胃液來源較為單一，其反映上消化道腫瘤具有顯著優勢。通過構建胃液RMRP的ROC曲線，發現AUC為0.699，結合其靈敏度和特異度分別為0.56和0.75，有較高的臨床診斷價值。早期診斷是降低胃癌病死率的關鍵一環[19]，腫瘤標志物聯合檢測是提高胃癌檢出率的重要手段。通過聯合血清或胃液CEA和胃液RMRP，檢測了早期胃癌和進展期胃癌的陽性率，發現胃液RMRP聯合血清或胃液CEA篩查胃癌的效果明顯優于傳統腫瘤標志物血清CEA，聯合檢測胃液RMRP、血清CEA和胃液CEA可提高胃癌檢出率。

本研究證實了胃癌相關lncRNA的存在，并進一步分析了胃癌相關lncRNA RMRP在胃液中的臨床意義。胃液RMRP作為潛在的早期胃癌篩查標志物，為臨床診治胃癌研究提供了新的思路。

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