細(xì)梗香草皂苷聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞BxPC-3抑制作用的研究

于賢金 何亞紅 張?bào)泺P

近年來，胰腺癌的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)逐年上升。美國2017年預(yù)計(jì)胰腺癌新發(fā)53 670例，死亡43 090例，排在所有腫瘤死亡原因的第4位[1]，預(yù)計(jì)到2020年，將排在所有腫瘤死亡原因的第2位[2]。大部分胰腺癌患者確診時(shí)已屬于晚期，僅有10%～15%的患者有根治手術(shù)機(jī)會(huì)[3]。因此，以吉西他濱（gemcitabine，GEM）為基礎(chǔ)的化療成為進(jìn)展期胰腺癌患者的重要治療方法[4]。GEM可顯著提高疾病無進(jìn)展時(shí)間及3～5年生存率，但在中位生存期及1年生存率方面提高仍不明顯[5]。細(xì)梗香草又名滿山香、香排草，為報(bào)春花科珍珠菜屬植物，民間將細(xì)梗香草用于治療感冒咳嗽、風(fēng)濕痹痛、抗腫瘤等，該植物中的主要成分皂苷有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[6]。相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，皂苷對(duì)于肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等癌癥均有一定的抑制作用[7-8]。本研究觀察了細(xì)梗香草皂苷（lysimachia capillipes，LC）單獨(dú)及與GEM聯(lián)用對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步研究了LC抗胰腺癌的作用機(jī)制，為探討臨床LC聯(lián)用GEM治療胰腺癌的可行性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 BxPC-3細(xì)胞株由上海長海醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。LC由浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。GEM（健擇/Gemzar）由美國禮來公司提供（規(guī)格200mg），保存于4℃冰箱。RPMI-1640培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA（0.25%）胰蛋白酶、FBS、青霉素-鏈霉素抗生素購于美國GIBCO公司。MTS細(xì)胞增殖試劑盒（MTS法）購于美國艾美捷科技有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑及細(xì)胞周期檢測試劑購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。抗多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抗體、抗半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體購于英國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。細(xì)胞單層貼壁生長，至70%～80%時(shí)胰蛋白酶消化傳代。取復(fù)蘇傳代后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 將BxPC-3細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后分別加入0、2、4、8、16、32、64、100μg/ml 的 LC 和 0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L的GEM，繼續(xù)培養(yǎng)48h。采用MTS法檢測細(xì)胞增殖抑制率，吸棄原來的培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基100μl/孔，再加入 MTS 試劑 20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 1h，用酶標(biāo)儀測定490nm處的吸光度（OD）。細(xì)胞增殖抑制率=（1-觀察組OD490/對(duì)照組OD490）×100%，細(xì)胞存活率=100%-細(xì)胞增殖抑制率。再以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制量效曲線，得到半抑制濃度（IC50）。1.2.3 藥物聯(lián)用實(shí)驗(yàn) 將BxPC-3細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后聯(lián)合加入LC與GEM（根據(jù)細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整濃度梯度：LC為5、10、15、20、25μg/ml，GEM 為 1、3、5、10、30μmol/L，并分別配對(duì)）。采用MTS法檢測并計(jì)算出各藥物濃度下細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算出藥物聯(lián)合作用指數(shù)（combined index，CI）。CI判斷兩種藥物的協(xié)同性，CI=DA/ICX，A+DB/ICX,B（A和B代表兩種不同藥物，ICX,A和ICX,B是兩種藥物單獨(dú)使用使增殖抑制率達(dá)X時(shí)的藥物濃度，DA和DB是兩種藥物聯(lián)合作用使增殖抑制率達(dá)X時(shí)的藥物濃度）。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Calcusyn 2.0軟件計(jì)算LC與GEM聯(lián)用的CI值。CI值大于、等于和小于1，分別對(duì)應(yīng)了兩種藥物具有拮抗、疊加和協(xié)同作用，當(dāng)CI值＜1時(shí)，數(shù)值越小，協(xié)同作用越大[9]。

1.2.4 細(xì)胞處理與分組 選取對(duì)數(shù)生長期的BxPC-3細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后加入不同濃度藥物，分為（1）對(duì)照空白組：不加藥物干預(yù)（A 組）；（2）GEM 1μmol/L 組（B 組）；（3）LC 15μg/ml組（C 組）；（4）GEM 1μmol/L+LC 15μg/ml組（D 組）。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 根據(jù)1.2.4處理與分組細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用不含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，收集（1～5）×105細(xì)胞。加入100μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，輕輕混勻。避光、室溫反應(yīng) 10min。加入 400μl 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot法檢測PARP、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 根據(jù)1.2.4處理與分組細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，制備10%SDS-PAGE凝膠。每孔加入20μg樣品進(jìn)行電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉液封閉 1h，分別加入相應(yīng)一抗（1∶1 000 稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜 3次，二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育 1h，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，以β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin）為內(nèi)參，檢驗(yàn)試驗(yàn)準(zhǔn)確性。Band Leader軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的LC和GEM對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制率 不同濃度的LC和GEM干預(yù)BxPC-3細(xì)胞并培養(yǎng) 48h后，8～64μg/ml的 LC 及 1.25～20μmol/L 的 GEM均對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈濃度依賴性， 其IC50分別為16.55μg/ml和1.27μmol/L，見圖1-2。

圖1 LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2 GEM對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過Calcusyn 2.0軟件計(jì)算出 15μg/ml與 20μg/ml的 LC與各濃度 GEM 的 CI值均＜1，具有協(xié)同作用。其中15μg/ml的LC與各個(gè)濃度的GEM協(xié)同作用最強(qiáng)，CI值為0.53～0.65，見表1。結(jié)合兩種藥物的IC50值結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選取單用GEM 1μmol/L，LC 15μg/ml，聯(lián)用藥物 GEM 1μmol/L+LC 15μg/ml的濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 藥物對(duì)BxPC-3細(xì)胞凋亡的影響 藥物作用于BxPC-3細(xì)胞 48h后，A、B、C、D 組早期凋亡率分別為（0.8±0.22）%、（16.0±0.33）%、（64.5±0.29）%、（93.2±0.29）%，晚期凋亡率分別為（1.9±0.50）%、（12.3±0.58）%、（9.7±0.50）%、（2.8±0.24）%，見圖 3。B、C、D 組的早、晚期凋亡率與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），且D組與B、C組的早期凋亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）。

表1 各濃度LC與GEM聯(lián)合用藥的CI值

圖3 細(xì)胞凋亡流式分析圖

2.4 4組PARP和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 C、D組與A組比較，PARP蛋白表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）；B、C、D 組與 A 組比較，Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加（均 P＜0.05），見圖 4-5。

3 討論

目前胰腺癌病因尚不明確，可能的危險(xiǎn)因素有年齡、吸煙、酒精攝入、肥胖、慢性胰腺炎、基因改變和飲食等[10]，發(fā)病機(jī)制的不明確造成了治療進(jìn)展停滯不前。胰腺癌早期診斷極其困難，只有少部分患者發(fā)現(xiàn)后有機(jī)會(huì)進(jìn)行根治性手術(shù)治療。GEM是胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物[4]。GEM可顯著提高疾病無進(jìn)展時(shí)間及3～5年生存率，但在中位生存期及1年生存率方面提高不明顯[5]。而GEM聯(lián)合其他藥物或放療，治療效果也未見顯著優(yōu)勢，聯(lián)合化療還可能增加細(xì)胞毒性反應(yīng)[11-15]。其他治療如內(nèi)鏡治療包括內(nèi)鏡下化療、冷凍療法、光動(dòng)力和射頻消融等方法，但沒有臨床證據(jù)支持其療效優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)療法[16]。

圖4 4組PARP和Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

圖5 4組PARP和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（注：與A組相比，*P＜0.05）

在我國，傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)于疾病的觀點(diǎn)及治療有著顯著的特色，其在腫瘤的治療方面也取得了不少突破。晚期腫瘤患者以中醫(yī)藥為主治療可明顯提高生活質(zhì)量，延長生存期。而且中藥與化療伍用還具有較為顯著的增效減毒作用。有研究表明中藥可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與分化以及中藥逆轉(zhuǎn)多藥耐藥效應(yīng)[17]。LC已在體外試驗(yàn)中被證實(shí)對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)采取MTS法檢測LC單獨(dú)及與GEM聯(lián)用對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示LC、GEM對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)15μg/ml的LC與1μmol/L的GEM的CI值為0.58，有高度協(xié)同作用。此時(shí)兩藥濃度都小于各自的IC50濃度，說明LC可增加GEM抗腫瘤療效。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體正常細(xì)胞受到生理和病理性刺激后自發(fā)的程序性死亡，可及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)受損傷和異常的細(xì)胞，維持組織器官的穩(wěn)定性。它的啟動(dòng)與進(jìn)行受到精確而復(fù)雜的信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控。影響細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，是抗腫瘤藥物抑制腫瘤的一條重要作用機(jī)制。Caspase基因家族在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，在胰腺癌細(xì)胞的凋亡中起到極其重要的作用，許多研究表明胰腺癌的致病機(jī)制及靶點(diǎn)均通過Caspase家族起作用[18-20]，其中Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要的效應(yīng)型關(guān)鍵凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起后樞紐作用[21]，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，最終均需要通過Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，很多腫瘤組織中Caspase-3表達(dá)量較正常組織明顯降低。另外，PARP能通過識(shí)別結(jié)構(gòu)損傷的DNA片段而被激活，被認(rèn)為是DNA損傷的感受器，能參與修復(fù)受損 DNA、保持染色體結(jié)構(gòu)完整性。Caspase-3能特異性分解PARP使其失去結(jié)合DNA的能力，抑制其修復(fù)DNA[22]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LC、GEM單藥及聯(lián)合用藥作用于人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合用藥組凋亡率明顯高于單藥組。另外，筆者觀察到LC單藥組與LC、GEM聯(lián)合用藥作用于BxPC-3細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，PARP蛋白表達(dá)減少。LC及其聯(lián)合用藥抑制胰腺癌細(xì)胞質(zhì)增殖及促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過Caspas-3和PARP途徑來實(shí)現(xiàn)。至于是通過哪種細(xì)胞信號(hào)通路和信號(hào)分子激活這兩種酶，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了LC對(duì)人胰腺癌細(xì)胞具有抑制作用，LC與GEM具有高度協(xié)同作用，聯(lián)合用藥可提高療效。LC可能是通過激活Caspase-3，分解PARP，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究LC抗胰腺癌的信號(hào)通路機(jī)制及LC用于胰腺癌臨床研究提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Siegel RL,Miller KD,Jemal A．Cancer statistics,2017[J]．CA Cancer J Clin,2017,67(1):7-30．doi:10．3322/caac．21387．

[2] Ko AH．Progress in the treatment of metastatic pancreatic cancer and the search for next opportunities[J]．J Clin Oncol,2015,33(16):1779-1786．doi:10．1200/JCO．2014．59．7625．

[3]Stathis A,Moore MJ．Advanced pancreatic carcinoma:current treatment and future challenges[J]．Nat Rev Clin Oncol,2010,7(3):163-172．doi:10．1038/nrclinonc．2009．236．

[4] Oettle H,Post S,Neuhaus P,et al．Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer:A randomized controlled trial[J]．JAMA,2007,297(3):267-277．doi:10．1001/jama．297．3．267．

[5] Neuhaus P,Riess H,Schramm H,et al．CONKO-001:Final results of therandomized,prospective,multicenter phase III trial of adjuvant chemotherapy with gemcitabine versus observation in patients with resected pancreatic cancer(PC)[J]．J Clin Oncol,2008,26(Suppl):Abstr LBA4504．doi:10．1200/jco．2005．23．16_suppl．lba4013．

[6] 田景奎,鄒忠梅,徐麗珍,等．細(xì)梗香草化學(xué)成分的研究[J]．中國藥學(xué)雜志,2006,41(3):171-173．doi:10．3321/j．issn:1001-2494．2006．03．004．

[7] 費(fèi)正華,陳云亮,馬勝林．細(xì)梗香草總皂苷誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H460凋亡及其機(jī)制的研究[J]．浙江醫(yī)學(xué),2014,36(9):742-746．

[8] 徐燕,榮語媚,劉小保,等．細(xì)梗香草總皂苷的抗腫瘤活性研究[J]．中國藥理學(xué)通,2012,28(4):545-549．doi:10．3969/j．issn．1001-1978．2012．04．024．

[9] Wang D,Wang Z,Tian Y,et al．Two hour exposure to sodium butyrate sensitizes bladder cancer to anticancer drugs[J]．Int J Urol,2008,15(5):435-441．doi:10．1111/j．1442-2042．2008．02025．x．

[10] Zhang Q,Zeng L,Huang K,et al．Pancreatic cancer epidemiology,detection,and management[J]．Gastroenterol Res Pract,2016,2016:1-10．doi:10．1155/2016/8962321．

[11] Von Hoff DD,Ervin T,Arena PF,et al．Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine[J]．N Engl J Med,2013,369(18):1691-1703．doi:10．1056/NEJMoa-1304369．

[12] Ueno H,Ioka T,Ikeda M,et al．Randomized phase Ⅲ study of gemcitabine plus S-1,S-1 alone,or gemcitabine alone in patients with locally advanced and metastatic pancreatic cancer in Japan and taiwai:GEST study[J]．J Clin Oncol,2013,31(13):1640-1648．doi:10．1200/JCO．2012．43．3680．

[13] Altwegg R,Ychou M,Guillaumon V,et al．Second-line therapy for gemcitabine-pretreated advanced or metastatic pancreatic cancer[J]．World J Gastroenterol,2012,18(12):1357-1364．doi:10．3748/wjg．v18．i12．1357．

[14] Reni M,Cereda S,Milella M,et al．Maintenance sunitinib or observation in metastatic pancreatic adenocarcinoma:a phase II randomised trial[J]．Eur J Cancer,2013,49(17):3609-3615．doi:10．1016/j．ejca．2013．06．041．

[15]LeeHS,ParkSW．Systemicchemotherapyinadvancedpancreatic cancer[J]．Gut Iver,2016,10(3):340-347．doi:10．5009/gnl 15465．

[16] Vincent A,Herman J,Goggins AM,et al．Pancreatic cancer[J]．Lancet,2011,378(9791):607-620．doi:10．1016/S0140-6736(10)62307-0．

[17] 李峨,陳信義,王玉芝．九種中藥活性成分抗耐藥腫瘤細(xì)胞體外研究[J]．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2004,27(2):24-26．doi:10．3321/j．issn:1006-2157．2004．02．008．

[18] Srivastava SK,Bhardwaj A,Singh AP,et al．MicroRNA-345 induces apoptosis in pancreatic cancer cells through potentiation of caspase-dependent and-independent pathways[J]．BrJCancer,2015,113(4):660-668．doi:10．1038/bjc．2015．252．

[19] Geisen U,Zenthoefer M,Kalthoff H,et al．Molecular mechanisms by which a fucus vesiculosus extract mediates cell cycle inhibition and cell death in pancreatic cancer cells[J]．Mar rugs,2015,13(7):4470-4491．doi:10．3390/md13074470．

[20] Jakubowska K,Guzińska-Ustymowicz K,Pryczynicz A,et al．Reduced expression of caspase-8 and cleaved caspase-3 in pancreatic ductal adenocarcinoma cells[J]．Oncol Lett,2016,11(3):1879-1884．doi:10．3892/ol．2016．4125．

[21] 葛建彬,顧錦華,李梅,等．銀杏內(nèi)酯A對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)p53、Caspase-3表達(dá)的機(jī)制[J]．中國藥理學(xué)通報(bào),2012,28(8):1105-1110．

[22]Germain M,Affar EB,D'Amours D,et al．Cleavage of automodified poly(ADP-ribose)polymerase during apoptosis．Evidence for involvement of caspase-7[J]．J Biol Chem,1999,274(40):28379-28384．doi:10．1074/jbc．274．40．28379．