ABT737對ZM447439促進乳腺癌細胞凋亡的影響

張 月 王耀一 孫光源 姜偉華 孫 健 范敬靜 張志生 信國峰 宋文麗 費建東

(河北北方學院附屬第一醫院乳腺外科，河北 張家口 075000)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其治療已規范化，靶向治療成為大趨勢。化療藥物治療效果明顯，但副作用大；靶向治療針對靶點，治療明確。Aurora 激酶、Bcl-2家族作為新的靶點，以它們為靶點治療的聯合應用為乳腺癌治療開辟了新思路。本研究主要檢測ABT737增強ZM447439抑制人乳腺癌細胞的增殖效應，誘導凋亡并且初步探討與其相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細胞株T47D、MDA-MB-231由河北北方學院中心實驗室提供；ZM447439、ABT737購自selleck公司；RPMI 1640培養基購自Gibico公司；胎牛血清購自Hyclone公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；p-AuroraA、 p-組蛋白(Histone)H3、AuroraA、HistoneH3、細胞周期蛋白(Cyclin)B1、p-cdc25c、cdc25c、p-cdc2、cdc2、p21、p53 Bax、Bcl-2、Bcl-xl、PARP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞培養 T47D、MDA-MB-231細胞株常規培養于RPMI1640培養液中，內加10%胎牛血清、人青霉素(濃度100 U/ml)和鏈霉素(濃度100 μg/ml)，于37℃、 5% CO2培養箱中培養。分為對照組和實驗組(含ZM447439的RPMI 1640培養液)，設計ZM447439濃度分別為0、100 μmol/L處理24 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態的變化。

1.33-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測定細胞活性 將細胞接種于96孔板(1×104個/孔)，每組設3個平行孔，細胞按分組處理后，更換新鮮培養液(200 μl)；每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)孵育4 h，棄培養液，加入200 μl二甲基亞砜，震蕩混勻，待顆粒溶解后，酶標儀波長570 nm處檢測各孔光濃度值 (OD值)。

1.4克隆形成實驗檢測細胞增殖 處理細胞懸液，保證6孔板每孔細胞50個左右。將其分為對照組和實驗組處理4 h后，棄去，RPMI1640培養液培養15 d后，棄去；預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)輕晃立即棄去；加10%甲醇固定30 min，然后用PBS洗滌至甲醇干凈，自然晾干，加入0.1%結晶紫對細胞染色30 min后用蒸餾水洗滌，置于空氣中到干燥為止，采圖。

1.5免疫熒光觀察紡錘體及核的改變 對細胞進行消化、計數，調整細胞密度至103/ml。把預先處理的無菌玻片放入12孔板中，將以上細胞懸液滴入每孔(保證每孔為2 ml)，放入37℃、5% CO2孵箱中培養過夜使其貼壁。給予ZM447439 1 μmol/L處理48 h后，將培養液棄去；用預冷的1倍PBS洗3次(5 min/次)，經4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、DAPI著色5～10 min，1倍PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下觀察，共聚焦顯微鏡下采圖。

1.6Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉法將蛋白電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫纖維素膜用含5%牛奶TBST封閉0.5 h；加入一抗(稀釋比例為1∶1 000其中β-actin抗體稀釋比例為1∶10 000)4℃過夜；TBST洗滌 3次，然后與二抗(辣根過氧化物酶標記，稀釋比例1∶10 000)室溫孵育1 h后TBST洗滌3次；電化學發光法(ECL)顯影，曝光。

1.7流式細胞術檢測細胞周期 分別用對照組(未處理)、抑制劑組(ZM447439 0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L)處理T47D 、MDA-MB-231 24 h，1 μmol/L作用48 h后，收集細胞并調整細胞數至1×106個/ml，用冷PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min兩次；預冷的95%乙醇固定，離心乙醇固定的細胞，棄去乙醇，加入PI(50 μg/ml)與RNase(1 μg/ml)混合物500 μl作用15 min后，在流式細胞儀上機分析，檢測1×104個細胞，并用multicycle軟件進行細胞周期的分析。

1.8熒光染色觀察細胞形態學變化 分別用對照組(未處理)、實驗組處理T47D細胞72 h后，分別加入終濃度為5 μg/ml的Hoechst33342、 250 nmol/L的 MitoTracker Red和1 μmol/L的Yo-pro-1，室溫孵育30 min后，倒置熒光顯微鏡下觀察。 Yo-pro-1可透過凋亡細胞的細胞膜，但不能透過活細胞的細胞膜。

1.9流式細胞術檢測細胞凋亡率 分別用對照組(未處理)、實驗組分別處理T47D 48 h后，收集細胞，并調整的細胞數至1×106個/ml，用冷PBS洗滌細胞兩次。加入結合緩沖液100 μl、FITC Annexin-Ⅴ 5 μl、PI(50 μg/ml)10 μl，室溫避光孵育15 min后加入結合緩沖液400 μl細胞懸液中加入孵育20～30 min。流式細胞儀FACScan測定，經計算機軟件處理計算凋亡細胞百分率。

1.10統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1ZM447439抑制乳腺癌細胞生長及增殖 MTT法顯示隨著濃度和時間增加ZM447439呈現明顯的量效關系，24、48、72 h的IC50值分別為(8.01±0.96)、(3.62±0.41)、(0.42±0.11)μmol/L(圖1)；克隆形成實驗結果顯示，隨著ZM447439濃度的增加克隆形成的數目減少(圖2)。倒置顯微鏡下觀察，100 μmol/LZM447439作用24 h，T47D、MDA-MB-231細胞出現細胞皺縮、破裂，失去正常形態，細胞內出現空泡及顆粒，細胞間隙增大，部分細胞失去貼壁能力，細胞數量未見增加。見圖3。

圖1 MTT檢測不同濃度不同時間ZM447439對T47D細胞抑制率曲線

圖2 ZM447439對T47D、MDA-MB-231對細胞克隆形成的影響

2.2ZM447439對P-Histome H3、P-AuroraA及周期特異性、調節性指標的影響 P-Aurora A、P-Histone的表達隨著ZM447439濃度增加逐漸減弱，Cyclin B1、p-cdc25c、p-cdc2、p21、p53是G2/M期的周期特異性及調節性指標，隨著ZM447439濃度增加，CyclinB1的表達逐漸減少；其他指標的表達逐漸增加(圖4)。

2.3ZM447439對乳腺癌細胞核紡錘體的影響及多核細胞的形成 ZM447439 0、1 μmol/L作用于T47D 48 h，紡錘體的結構紊亂、細胞核出現改變；在沒有ZM447439的作用下，MDA-MB-231細胞核分布均勻，無明顯分葉的變化。經1 μmol/L ZM447439作用48 h后，細胞核出現分葉狀，產生多核細胞。見圖5，圖6。

圖3 兩組T47D、MDAMB-231在倒置顯微鏡下的細胞形態(×40)

圖4 ZM447439對Aurora A、HistoneH3自身磷酸化及周期特異性指標的影響

圖5 ZM447439對乳腺癌T47D細胞核紡錘體的影響及多核細胞的形成(×200)

2.4流式細胞術對DNA倍體分析 1 μmol/L ZM447439作用48 h，乳腺癌細胞產生多倍體(圖7)。T47D、MDA-MB-231細胞系在ZM447439不同濃度作用下，G0/G1、S期細胞百分比減少，G2/M期細胞百分比增加；G2/M期細胞占細胞總數的百分比隨著濃度的增加有明顯增多的趨勢，而相對應G0/G1期、S期細胞占細胞總數的百分比減少，見表1。

2.5ABT737與ZM447439對乳腺癌細胞的影響 不同濃度ZM447439作用不同時間，PARP的剪切帶呈現濃度及時間的依賴性。不同濃度ZM447439加入1 μmol/L ABT737作用48 h，PARP、Caspase3剪切帶明顯增加，Bax表達增加，Bcl-2表達減少,見圖8。熒光染料及FITC Annexin-Ⅴ流式細胞術顯示，1 μmol/L ABT737+1 μmol/L ZM447439聯合組作用48 h細胞凋亡率〔(4%5.30±0.32)%〕明顯高于對照組、1 μmol/L ABT737及1 μmol/L ZM447439作用48 h的(0.31±0.03)%、(17.46±0.39)%、(28.21±0.48)，見圖9。

圖7 流式細胞術對DNA倍體分析

1～6：0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L ZM447439圖8 ABT737與ZM447439對乳腺癌細胞的影響

濃度(μmol/L)T47DG0/G1期S期G2/M期MDA-MB-231G0/G1期S期G2/M期050.9±0.5533.6±0.5914.7±0.3248.5±0.6630.1±0.3015.9±0.530.00152.9±0.4929.7±0.1517.3±0.1537.0±0.4628.8±0.3117.5±0.640.01049.6±0.6420.5±0.2130.8±0.3131.4±0.8020.6±0.8229.9±0.440.10053.2±0.3117.6±0.3136.2±0.1517.3±0.554.6±0.4029.3±0.311.00025.6±0.4216.2±0.1058.2±0.508.8±0.254.2±0.3148.2±0.4910.0009.5±0.204.51±0.5185.8±0.326.1±0.210.1±0.1586.0±0.35

圖9 熒光染料顯示各組細胞凋亡率(×100)

3 討 論

Aurora激酶在許多上皮惡性腫瘤中有擴增，與腫瘤形成密切相關，它們在多種腫瘤細胞如乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等中過表達〔1〕。AuroraA、B、C是Aurora激酶家族中的3個成員，主要在調節中心體成熟、有絲分裂紡錘體形成、胞質分裂中占有重要的地位。AuroraA已被證實可作為乳腺癌獨立的預后因素〔2〕，主要在G2/M期達到高峰，調節細胞周期中G2/M轉換，是調節M期進展的關鍵因子〔3〕，AuroraA通過自身磷酸化發揮作用。研究表明，ZM447439是ATP競爭性結合性小分子Aurora激酶抑制劑，可抑制細胞增殖，抑制HistoneH3磷酸化，細胞出現多倍體現象，胞質分裂失敗〔4〕。另外，ZM447439在結腸癌細胞中有抑制腫瘤細胞增殖，阻斷微管形成的作用，從而發生細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡〔5〕。

CyclinB1是細胞周期中一種重要的蛋白，使細胞通過G2/M期的檢查點，促進細胞G2/M期的轉換，它在有絲分裂中后期被降解，促進有絲分裂完成，促使細胞周期的運行。CyclinB1為P-AuroraA的下游基因，在間期開始累積，且越接近有絲分裂期水平越高，CyclinB1可以促使細胞G2/M期的轉化〔5〕，因而干擾P-AuroraA形成會影響到G2/M細胞周期的運行，使細胞發生凋亡。Cdc25c在間期存在于胞質中，有絲分裂開始時才轉運到核中行使去磷酸化功能。Cdc25c可以將CDK1的Thr14位點(cdc2)去磷酸化從而激活CyclinB/CDK1復合物〔6〕，p21負向調控CyclinB/CDK1，使其發生G2/M期阻滯，Bax能自身形成同源二聚體(Bax/Bax)而誘導凋亡，Bcl-2則可與Bax形成異源二聚體(Bcl-2/Bax)以抑制凋亡，Bax、Bak活化后在線粒體膜上形成二聚體，增加了線粒體外膜通透性，釋放出細胞色素C等促凋亡分子，激活Caspase9，再激活下游的Caspase3，導致細胞凋亡〔7〕。

ABT737與Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w有較高親和力，能促進高表達Bcl-2的腫瘤細胞凋亡。ABT737單藥對小細胞肺癌(SCLC)、濾泡性淋巴瘤/彌漫大B細胞淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病細胞系最有效，可使小鼠模型異種移植的SCLC完全消失、骨髓瘤生長受抑制〔8〕。對多數腫瘤細胞系，特別是實體腫瘤，單藥的細胞殺傷活性較差。ABT737能提高腫瘤細胞對放化療的敏感性，與多種化療藥物如依托泊苷、阿糖胞苷、多柔比星、順鉑、紫杉醇等合用時可顯著降低這些藥物的EC50，減少其副作用〔9〕。本實驗發現ABT737還能提高小分子Aurora激酶抑制劑ZM447439的敏感性。

ZM447439抑制AuroraA和HistoneH3的磷酸化，使細胞在G2/M期阻滯，從而抑制乳腺癌細胞的生長〔10〕。ZM447439抑制乳腺癌細胞增殖發生凋亡通過兩種途徑：(1)抑制P-AuroraA及P-AuroraB的形成。(2)抑制p-Histone H3 形成，形成多倍體細胞和很少部分二倍體細胞，二倍體細胞在藥物的作用下隨著時間推移最終和多倍體細胞一樣形成非整倍體，發生凋亡，從而使促凋亡蛋白Bax表達增加，Bcl-2蛋白表達量減少，ABT737為小分子Bcl-2抑制劑，抑制Bcl-2/Bcl-xl的表達，從而使Bax的表達增加。

ZM447439可抑制乳腺癌細胞AuroraA自身磷酸化，p-cdc25c、p-cdc2表達增加，下調CyclinB1的活性，從而發生G2/M期阻滯，使細胞停滯生長，抑制P-HistoneH3，多倍細胞形成，最終形成非整倍體，細胞發生凋亡，凋亡相關指標發生改變，1 μmol/L ABT737的介入，使促凋亡蛋白表達明顯增加，加速乳腺癌細胞發生凋亡。

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