槐耳醇提取物通過抑制胃癌細胞周期影響胃癌增殖的研究

倪益秀 胡燦 孔炫棟 王曉峰 徐志遠 程向東?

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，對人民的健康構成巨大威脅，在臨床上有多種有效的治療方案［1-3］。根治性手術是最有效的治療手段，但患者術后易復發［4-5］。近年來，中醫中藥類在胃癌患者的治療中發揮著越來越重要的作用，尤其是對中晚期胃癌的患者。槐耳是一種中藥，自從發現其有抗腫瘤作用以來，作為癌癥治療的補充療法，在中國已被廣泛使用［6］。而槐耳醇提取物是近幾年出現的將中藥槐耳提純至較高純度的制劑［7-8］，與傳統水提取物相比，其不僅藥用純度更高，而且毒性低。槐耳醇提取物作為一種新興的中藥提取物，已有相關實驗證明其胃癌細胞有一定的殺傷作用。本實驗的目的是為了探究槐耳醇提取物對胃癌細胞增殖抑制作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：裸鼠（BALB/c-nu，浙江中醫藥大學動物中心提供），雌性20只，鼠齡3～5周。（2）實驗藥品：槐耳醇提取物（浙江省中醫院中心實驗室提供）制成100mg/ml的二甲基亞砜（DMSO）溶液。（3）主要試劑：RPMI Medium Modified 1640（美國HyClone公司）；胎牛血清FBS（Gibco）；胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技有限公司）；Cell Counting Kit-8（杭州諾揚生物有限公司）；Phosphate Buffered Saline（美國HyCloneTM公司）；膜聯蛋白V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（San Diego，CA，USA）；DMSO（美國Amresco公司）。（4）主要儀器：倒置熒光顯微鏡（日本OLYM-PUS公司，IX71）；多功能全波長酶標儀（Thermo）；CO2恒溫培養箱（Thermo，型號3111）；生物安全柜（Thermo，型號1287）；臺式冷凍多用離心 機（Thermo，型 號CL31R）。（5）細 胞 株：AGS、HGC-27、MGC-803細胞株（浙江省中醫院中心實驗室提供）。

1.2 實驗方法 （1）細胞培養：用體積分數為10%的胎牛血清RPMI-1640培養液，在37℃、5%的CO2培養箱中培養，細胞呈貼壁生長，取對數生長期細胞用于實驗。（2）測定不同濃度槐耳醇提取物對胃癌細胞的增殖抑制作用：收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度為5×104/ml，接種于96孔板，每孔加入100μl，37℃、5%的培養箱中孵育24h至細胞單層鋪滿孔底。分別加入終濃度為1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625μg/ml和0μg/ml的槐耳醇提取物樣品溶液，每個濃度設3個復孔，同時設1個平行空白對照孔，陰性對照組加不含藥物的RPMI-1640培養液，培養24h后，用細胞計數試劑盒-8測試細胞活力。將10μl的CCK-8溶液加入至每個孔中，隨后將96孔板在37℃下溫育1h或2h。在450nm波長處檢測OD值以確定酶標儀（Thermo）上的細胞活力。該測定進行≥3次。如下計算細胞活力：抑制率=（OD對照-OD實驗）/（OD對照-OD空白）×100%。（3）劃痕實驗：將胃癌細胞AGS和MGC-803分別接種于Ibidi公司的插件中，每孔接種1.0×107個細胞，培養24h后，拔除插件，用PBS清洗2遍，加入無血清RPMI-1640溶液，分別觀察并拍攝0h、4h、8h、12h、24h、32h的遷移情況。

1.3 流式細胞術測細胞周期和細胞凋亡 在確定細胞凋亡之前，將MGC-803細胞預處理，然后與PBS，0.1、0.2、0.3mg/ml的槐耳醇提取物一起溫育48h。隨后，收集附著細胞和漂浮細胞并使用膜聯蛋白V-FITC/PI染色試劑盒（BD Biosciences）分析。細胞用冷PBS洗滌，重懸于結合緩沖液中，并用膜聯蛋白V-FITC染色10min，并在黑暗中PI染色5min。用熒光激活細胞分選（FACS）流式細胞儀（BD Biosciences）定量凋亡細胞。

1.4 蛋白質印跡實驗 溫育后，收獲使用PBS、槐耳清膏、槐耳醇提取物處理的細胞并裂解。對于蛋白質印跡分析，使用BCA蛋白質測定試劑盒定量的等量蛋白質進行10%SDS-PAGE，然后在硝酸纖維素膜上進行免疫印跡，然后在室溫下封閉5%脫脂牛奶2h，然后與指定的一抗（1：1000用于CyclinD1，肌動蛋白）在封閉溶液中于4℃孵育過夜。然后使印跡與HRP綴合的二抗反應，并使用ECL系統使用GAPDH水平作為對照來定量信號。

1.5 動物實驗 使用皮下接種法，在MGC-803細胞數目和細胞活性達到接種水平后，將細胞進行離心，用無血清1640進行稀釋，制成均勻的細胞懸濁液（1.0×107/ml）備用。將細胞懸濁液接種于5只小鼠右側腋窩皮膚，每只0.2ml。觀察接種小鼠成瘤情況，喂養2周見腫瘤長出后，取瘤體較大的腫塊，切成均勻的10mm3左右瘤塊，種植到小鼠右側腋下，使用PBS稀釋成0.5mg/kg的槐耳清膏和槐耳醇提取物灌胃。每2天測量裸鼠瘤體直徑大小。喂養1個月后處死，取出完整瘤體，比較各組腫瘤大小。

1.6 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料的多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槐耳醇提物作用后各組細胞活力比較 細胞實驗中槐耳醇提取物對胃癌細胞AGS、MGC-803具有增殖抑制作用，其抑制率隨著槐耳醇提取物濃度的增加而增加。其對胃癌細胞AGS、MGC-803的半抑制濃度（IC50）分別為0.1112mg/ml、0.2213mg/ml。

2.2 槐耳醇提物對胃癌細胞AGS和HGC-27遷移能力的影響 使用0.05mg/ml的槐耳醇提取物作用胃癌細胞AGS和HGC-27細胞可以發現，與空白對照組比較，隨著藥物作用時間的延長，劃痕愈合的速度變慢。在藥物作用32h時，與正常對照組相比，遷移面積縮小最為明顯，其次是24h時。說明槐耳醇提取物能在體外抑制AGS（圖1、2）和HGC-27胃癌細胞的遷移能力（圖3、4）。

圖1 AGS細胞遷移能力圖

2.3 流式細胞術分析結果 從流式細胞術圖中可以看出，用PBS或0.1、0.2、0.3mg/ml的槐耳醇提取物處理48h后，圖3A僅出現約6.5%凋亡細胞，隨后暴露于0.1、0.2、0.3mg/ml的槐耳醇提取物MGC-803細胞中，整個細胞中出現的凋亡細胞死亡量分別為45.3、55.6和66.8%（見圖5），證明槐耳醇提取物處理后MGC-803細胞發生凋亡。

2.4 Western blot檢 測 各 組CyclinD1表 達 結果 Western blot檢測用0.05mg/ml的槐耳清膏和槐耳醇提取物分別作用胃癌細胞MGC-803 48h后，使用槐耳組的細胞周期蛋白CyclinD1與空白對照組相比明顯降低，而相同濃度的槐耳醇提取物較槐耳清膏具有更強的增殖抑制作用。

2.5 荷瘤小鼠腫瘤抑制情況 在動物實驗中，觀察使用PBS、5mg/ml槐耳清膏、5mg/ml槐耳醇提取物對荷瘤小鼠皮下腫瘤的作用，發現其抑制作用十分明顯（P＜0.05），見圖6。

圖2 AGS細胞遷移相對愈合面積比

圖3 HGC-27細胞遷移能力圖

圖4 HGC-27細胞遷移相對愈合面積比

圖5 流式細胞術測MGC-803凋亡圖

3 討論

槐耳為多孔菌科栓菌屬真菌槐栓菌的子實體，過去的研究通常使用槐耳水提取物槐耳清膏，其能治療多種惡性腫瘤，在結腸癌、肝癌、胃癌等均有一定的作用。而槐耳醇提取物的成分較水提取物更為清晰，有研究表明，槐耳正丁醇部位具有顯著的殺傷腫瘤細胞的作用。本研究證明，槐耳醇提取物部分具有與槐耳水提取物及其多糖成分相同的抗腫瘤作用，不論是在細胞實驗還是體外動物模型試驗中槐耳醇提取物均有顯著抑制胃癌細胞增殖的作用，在CCK-8和荷瘤小鼠實驗中，使用相同濃度的槐耳醇提取物和槐耳水提取物時，槐耳醇提取物的胃癌細胞增殖抑制作用效率都高于槐耳水提取物。從Western blot實驗結果中可以看出，使用槐耳醇提取物組的CyclinD1蛋白明顯增加，說明胃癌細胞在G1期阻滯，其機制胃癌細胞增殖可能與抑制細胞周期G1期有密切的關聯，可證明槐耳醇提取物的藥用成分是有價值的，并且藥用價值不低于其水提取物，且槐耳醇提取物的心臟毒性和肝腎毒性都較傳統的水提取物低。然而槐耳醇提取物的藥物成分和其藥理作用還有待進一步研究，其在臨床中使用還需進一步探究。

圖6 1個月時小鼠腫瘤組織的生長情況