沉默β-catenin表達對胃癌細胞5-Fu敏感性的影響

潘安萍 朱建偉? 楊躍

胃癌的發病率占全球惡性腫瘤的發病率的第四位，其病死率占全球癌癥相關死亡的第二位，并隨著世界人口的增多及人口老齡化的演變，胃癌的發病人數還在不斷增加［1］。β-catenin是一多功能連環蛋白質，主要位于細胞膜，在惡性腫瘤細胞中普遍高表達，與惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移、藥物敏感等多種生物學行為密切相關［2］。本研究擬通過沉默胃癌細胞內β-catenin蛋白表達，探討β-catenin蛋白表達量與胃癌細胞化療藥物敏感性之間的關系。目前5-氟尿嘧啶（5-Fu）與順鉑兩藥聯合方案是臨床胃癌化療的基礎治療方案［3］。5-Fu被廣泛證實在胃腸道腫瘤治療中能使患者生存獲益，含5-Fu的兩藥聯合方案是胃癌臨床研究中常見的對照方案［4］。因此，本實驗選擇5-Fu藥物來探討β-catenin對胃癌細胞耐藥的影響。并初步探討其可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 胃癌細胞及主要試劑 AGS、MGC803細胞株購自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、空載體慢病毒液購于上海吉瑪公司；RT-PCR試劑盒購于美國Sigma公司；兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Santan Cruz公司；羊抗鼠、兔IgGHRP單克隆抗體均購于中杉金橋公司。

1.2 細胞培養 胃癌AGS、MGC803用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養，傳代1次/2d，按1：3比例傳代。

1.3 實驗分組 分別將慢病毒載體β-catenin-RNAi慢病毒液及空載慢病毒液分別感染AGS及MGC803細胞，實驗分組：實驗組（感染β-catenin-RNAi慢病毒液的AGS-RNAi、MGC803-RNAi）、陰性對照組（感染空載慢病毒的AGS-Neg、MGC803-Neg）、空白對照組（未處理的AGS、MGC803）。

1.4 病毒感染 將兩株細胞稀釋成1×104/ml，種6孔板，待細胞貼壁后實驗組及陰性對照組細胞每孔滴加各自慢病毒液，正常細胞組加入等體積的完全培養基。24h后給細胞換液，3d后熒光倒置顯微鏡下觀察熒光顯示情況。轉染效率=帶綠色熒光細胞數/總細胞數×100%。

1.5 Western blot分析各組細胞內β-catenin的表達量 蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，蛋白分析試劑盒分析蛋白濃度。配置聚丙烯凝膠，各組蛋白均取20μl行蛋白電泳，后將目的蛋白條帶轉移至NC膜，5%的脫脂奶粉封閉1h，一抗（1∶1000）4℃封閉過夜，二抗（1：2500）室溫封閉1h。暗室中滴加發光液后進行曝光、顯影、定影，得到的膠片可行結果分析，以β-ation為內參。

1.6 RT-PCR 分析各組細胞內β-catenin在基因水平表達情況，用Trizol提取各組細胞內的總RNA，用分光光度計測量提取的RNA的濃度，用逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄，用RT-PCR試劑盒進行RTPCR。

1.7 MTT法檢測各組細胞在不同濃度的5-Fu條件下的存活情況 各組細胞均稀釋至104/ml備用。5-Fu藥物共設7個藥物濃度梯度：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml。種96孔板：實驗組及對照組每孔加細胞懸液100μl，調零組每孔加100μl的完全培養基，每組均設置4個復孔。每組實驗細胞均種3板，分別于藥物作用24h、48h、72h后取出測量。取出的96孔板每孔加20μl MTT溶液，置培養箱中4h后終止，每孔加入150μl二甲基亞砜，低速振蕩10min，在酶聯免疫檢測儀490nm波長處測值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗。計數資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞的轉染情況 轉染4d后，熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光顯示情況與普通光鏡下作對比，實驗組、陰性對照組細胞顯示強綠色熒光，且帶綠色熒光的細胞數占總細胞數比例均＞80%，而空白對照組細胞無綠色熒光，兩組細胞熒光顯示情況見圖1。

2.2 各組細胞內β-catenin mRNA表達水平 RTPCR結果以2-ΔΔCt值為觀察指標，AGS、AGS-Neg、AGS-RNAi分別為2.09±0.13、2.00±0.10、1.04±0.08；MGC803、MGC803-Neg、MGC803-RNAi分 別 為1.11±0.07、1.23±0.12、0.45±0.06。兩株胃癌細胞均顯示實驗組細胞內β-catenin在基因水平較陰性對照組及空白對照組降低（P＜0.05），但陰性對照組及空白對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組細胞內β-catenin蛋白表達量 Western blot得出的蛋白條帶如圖2。Image J測出各組細胞內β-catenin蛋 白 相 對 表 達 量，AGS、AGS-Neg、AGS-RNAi分 別 為1.0371±0.0712、1.0667±0.0273、0.2452±0.0032；MGC803、MGC803-Neg、MGC803-RNAi分 別 為0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164。實驗組細胞內β-catenin蛋白表達均較陰性對照組及空白對照組降低（P＜0.05），陰性對照組及空白對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 實驗組細胞慢病毒感染后熒光顯微鏡及普通顯微鏡對比圖（×100）

2.4 β-catenin表達下調對胃癌細胞5-Fu敏感性的影響 MTT檢測結果顯示：相同濃度的5-Fu作用24h后對兩株實驗組細胞的抑制率明顯高于其相應陰性對照組（P＜0.01）。而相同濃度的5-Fu作用24h后對陰性對照組細胞及空白對照組細胞之間的增殖抑制率無明顯差異（P＞0.05）。相同濃度的5-Fu作用48h、72h后均得到類似的結果。

2.5 β-catenin表達下調對胃癌細胞中DPD、TS及P-gp表達的影響 Western blot檢測條帶如圖3。TS、P-gp在實驗組細胞中表達量較陰性對照及空白對照組均低（P＜0.01），而陰性對照組與空白對照組間無明顯差異（P＞0.05）；DPD蛋白表達量在各組間均無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 各組細胞內DPD、TS、P-gp蛋白表達條帶與內參條帶對比圖（注：1～6分別指AGS、AGS-Neg、AGS-RNAi、MGC803、MGC803-Neg、MGC803-RNAi）

3 討論

胃癌是一種常見疾病，具高發病率及病死率。隨著醫學發展，部分腫瘤通過早發現、用新藥、多學科聯合等多種手段，疾病控制率已明顯改善，然而胃癌疾病控制率及病死率一直居高不下。除了近年來胃癌治療的有效新藥更新外，還與現有的化療藥物耐藥嚴重有關。幾乎臨床化療的胃癌患者在治療過程中應用過5-Fu或其衍生物。但5-Fu的耐藥性問題不容忽視。β-catenin是Wnt信號通路中的關鍵蛋白，其被發現與腫瘤密切相關。β-catenin可通過影響Wnt信號通路下游的靶蛋白的表達來影響腫瘤細胞的多種生物學行為，其中除了細胞增殖、凋亡、侵襲轉移外，還能夠影響腫瘤細胞的化療藥物敏感性［2］。但是目前對于β-catenin與腫瘤化療藥敏之間關系的研究多數是在腸癌、乳腺、肝癌等中開展，對于胃癌細胞的研究尚少［5］。因此本研究選取β-catenin相對高表達的AGS、MGC803兩株胃癌細胞進行研究，以探討β-catenin蛋白表達對胃癌細胞5-Fu敏感性的影響。

本研究通過下調胃癌細胞AGS及MGC803中β-catenin蛋白表達，然后測量不同濃度的5-Fu藥物對慢性病毒感染前后細胞增殖率的影響。結果發現，下調了β-catenin蛋白表達之后的兩株胃癌細胞均對多個濃度的5-Fu較正常細胞出現更明顯的生長抑制，且AGS細胞株差異更顯著。作者猜測可能與沉默β-catenin蛋白表達效率在AGS細胞要高于MGC803細胞有關。因此，β-catenin低表達的細胞，對5-Fu藥物更敏感，而β-catenin高表達的胃癌細胞，易產生5-Fu耐藥。

目前國內外研究顯示，胃癌細胞耐藥與多藥耐藥（MDR）機制有關。MDR相關基因ABCB1編碼的一種P-糖蛋白（P-gp）在細胞內能作為一種轉運泵將多種細胞毒藥物轉運至胞外使得胞內藥物低水平，進而降低藥物療效引發耐藥［6］。近年來發現β-catenin作為轉錄因子能調控P-gp表達從而參與癌癥耐藥［7］。但是5-Fu的耐藥機制除了與MDR機制有關外，還有其自身特殊的機制。研究較多的是二氫嘧啶脫氫酶（DPD）及胸苷酸合成酶（TS）。DPD是5-Fu代謝的關鍵酶，其表達上調能加速5-Fu的降解從而降低藥物療效，有研究證實DPD的表達量與腸癌、食管癌的療效密切相關［8］。TS是5-Fu作用的靶酶，5-Fu與TS結合形成復合物能干擾DNA的合成，從而導致細胞死亡。研究證實TS低表達的腸癌患者更易從5-Fu為基礎的化療中獲益且預后相對更好［9］。

目前國內外關于腫瘤細胞5-Fu耐藥機制的研究眾多，基本明確與TS、DPD酶的表達量密切相關，且目前這類研究主要在腸癌細胞中進行［8］，關于胃癌細胞與5-Fu藥物敏感性之間的研究文獻不多，且尚無研究通過影響β-catenin蛋白表達來觀察其下游靶分子（TS、DPD、P-gp）表達異常后胃癌細胞對5-Fu敏感的變化，從而探討β-catenin蛋白表達與胃癌細胞5-Fu耐藥之間的關聯性，因此，本研究通過沉默β-catenin蛋白表達，初步探索胃癌細胞5-Fu耐藥進一步可能機制。

本研究得出β-catenin下調后的胃癌細胞內P-gp、DPD及TS的表達量也有部分改變。實驗組細胞中DPD的表達量與對照組無明顯差異，但P-gp及TS的表達量在實驗組細胞中均出現有統計學差異的下調。P-gp作為Wnt信號通路的下游靶蛋白，有可能參與了β-catenin對胃癌細胞5Fu敏感性的影響。但目前少有研究證實TS為β-catenin的下游靶蛋白，但是靶向Wnt信號通路其他成分間接通過TS酶影響5-Fu敏感性的研究已在腸癌、卵巢癌及口腔癌中有證實［5，9］。就目前來說，雖然關于TS酶表達與5-Fu敏感性之間的關系尚有爭議，但是大部分研究認為TS酶的表達量高的細胞更易產生5-Fu耐藥。且本研究同樣發現下調β-catenin表達后的胃癌細胞對5-Fu敏感性增強，同時TS酶的表達量下調。因此，β-catenin對胃癌細胞5-Fu敏感性的影響有可能是通過影響細胞內P-gp及TS蛋白表達來實現。