人工寒潮促發(fā)糖尿病大鼠腦卒中發(fā)病前腦組織中細(xì)胞粘附因子的變化

席秋江，韓莉，樓小亮

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330003)

流行病學(xué)調(diào)查和臨床觀察表明，在寒冷季節(jié)腦血管病的發(fā)病率明顯增高[1-3]，對(duì)多項(xiàng)氣象因素的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氣溫驟降是腦血管病最重要的預(yù)測(cè)因子[4]。關(guān)于低溫誘發(fā)腦血管病發(fā)病的機(jī)制還不十分清楚，大多數(shù)學(xué)者目前認(rèn)為可能的發(fā)生機(jī)制有[5，6]：血壓、血脂濃度、纖維蛋白濃度和血小板黏附。血管內(nèi)皮細(xì)胞當(dāng)受刺激后表達(dá)大量的細(xì)胞粘附分子，不但可與血小板附著，同時(shí)可導(dǎo)致循環(huán)中單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁，趨化巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而釋放大量炎性介質(zhì)，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。因此，細(xì)胞粘附分子在腦血管病的發(fā)生過程中有極其重要的作用。糖尿病（diabetes mellitus，DM）是腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，與動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成有關(guān)[7]。但細(xì)胞粘附分子在寒潮誘發(fā)有DM基礎(chǔ)的腦卒中過程中所起的作用尚未明確。本研究利用寒潮作為誘因研究大鼠腦卒中的發(fā)病情況，探討腦卒中的發(fā)病機(jī)制，為針對(duì)性預(yù)防冬季腦卒中發(fā)病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 選用健康雄性老年Sprague-Dawley(SD)大白鼠38只。在飼養(yǎng)和寒潮過程中出現(xiàn)腦卒中癥狀和體征的均被剔除。進(jìn)行分組：分為正常對(duì)照寒潮組7只、正常對(duì)照非寒潮組7只、DM寒潮組12只和DM非寒潮組12只等4個(gè)亞組。

1.2 人工模擬寒潮 按照國家氣象局規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，寒潮是指日平均氣溫在24h內(nèi)急劇降溫8℃或以上（或48h內(nèi)降溫10℃或以上），而且整個(gè)過程最低氣溫≤5℃。按照Li C[8]模擬人工寒潮，寒潮組置于人工氣候箱（寧波江南儀器廠）中，保持相對(duì)濕度65%不變，寒潮溫度設(shè)置以22℃ 12h，4℃ 12h為1d一個(gè)周期，共3個(gè)周期。非寒潮組置于相對(duì)濕度65%，溫度22℃的人工氣候箱共3個(gè)周期。

1.3 DM模型鼠的制備 參照文獻(xiàn)[9]制作DM模型。

1.4 觀測(cè)項(xiàng)目 注射STZ 4周后測(cè)量大鼠的體重、空腹血糖和空腹胰島素激素水平，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù) ISI＝[1/（空腹血糖值×空腹胰島素值）]。寒潮處理前后定期測(cè)量體重、空腹血糖和空腹胰島素水平，每天多次觀察大鼠的一般活動(dòng)情況。

1.5 標(biāo)本的取材和制備 以寒潮3d、出現(xiàn)偏癱癥狀或意識(shí)障礙、死亡為研究終點(diǎn)，在研究終點(diǎn)處死大鼠。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開胸，經(jīng)主動(dòng)脈灌流37℃生理鹽水200ml，繼以400ml 4%多聚甲醛固定液灌流固定，取腦入上述固定液中后固定約6h(4℃)后轉(zhuǎn)入30%蔗糖4℃過夜。第2d行恒冷箱冰凍切片(30μm)。視交叉層面每8張取1張切片作免疫組化；視交叉層面的其余切片及其余腦片連續(xù)切片后作HE染色，發(fā)生腦卒中者被剔出卒中前狀態(tài)的分析。每亞組隨機(jī)抽取6只大鼠標(biāo)本作免疫組化染色。

1.6 免疫組織化學(xué)ABC染色 按下列步驟對(duì)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)(ABC法)：⑴含1%Triton X-100和0.03%H2O2的0.01mol/L PBS室溫30min；⑵含 3%牛血清白蛋白(BSA，Pierce)和 1%正常羊血清 (NGS，Vector)的0.01mol/L PBS室溫30min；⑶兔抗 ICAM-1(1：50，美國 Sigma 公司)、VCAM(1：50，美國 Sigma 公司)、P-選擇素(1：50，美國Sigma公司)，室溫孵育過夜。抗體用含3%BSA和1%NGS的0.01mol/L PBS稀釋；⑷0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min；⑸生物素化羊抗兔IgG(1：200，Vector) 室溫 2h； ⑹0.01mol/L PBS 漂洗 3次，每次 10min；⑺ABC(1：100，Vector)室溫 2h；⑻0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min；⑼含0.03%DAB和0.006%H2O2的Tris鹽酸緩沖液室溫10-15min。⑽常規(guī)脫水、透明、樹脂封片；⑾普通光學(xué)顯微鏡觀察，拍照，所得圖片用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用S-N-K法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射STZ 4周后動(dòng)物模型評(píng)估 DM組注射STZ 4周后共有18只大鼠造模成功。DM組的體重與正常對(duì)照組的比較，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但DM組的空腹血糖和胰島素水平較正常對(duì)照組的明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01），DM組的胰島素敏感性較正常對(duì)照組減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。寒潮前DM組大鼠觀察可見三多一少癥狀，毛發(fā)和墊料潮濕，而放入寒潮后在開始降溫時(shí)大鼠處于一種 “易激惹”狀態(tài)，當(dāng)環(huán)境溫度低于10℃時(shí)，大鼠逐漸趨于平靜，出現(xiàn)被毛豎立、寒顫，飲水和進(jìn)食均減少，但排尿增多。在實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組和DM非寒潮組均無卒中癥狀或體征出現(xiàn)，而DM組在寒潮后有1只大鼠Longa評(píng)分3分，另2只大鼠死亡。

表1 注射STZ后4周大鼠體重、空腹血糖、胰島素和胰島素敏感性的變化

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 腦組織中ICAM-1水平表達(dá)的變化 各組大鼠腦皮質(zhì)中均見ICAM-1陽性表達(dá)的神經(jīng)元細(xì)胞。正常對(duì)照寒潮組與正常對(duì)照非寒潮組比較，大腦皮質(zhì)中的ICAM-1的光密度值無明顯差異 （P>0.05）。DM組與正常對(duì)照組比較，DM組的腦皮質(zhì)中的ICAM-1陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，）。DM寒潮組與DM非寒潮組比較，DM寒潮組的大鼠腦皮質(zhì)中的ICAM-1陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 （見圖 1、圖 3）。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)中ICAM-1的表達(dá)變化

圖3 各組大鼠腦皮質(zhì)中ICAM-1光密度值比較

2.2.2 腦組織中VCAM-1水平表達(dá)的變化 各組大鼠腦皮質(zhì)中均可見VCAM-1陽性表達(dá)的神經(jīng)元細(xì)胞。正常對(duì)照寒潮組與正常對(duì)照非寒潮組比較，大腦皮質(zhì)中的VCAM-1陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值無明顯差異 （P>0.05）。DM組與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠的腦皮質(zhì)中VCAM-1陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。DM寒潮組與DM非寒潮組比較，DM寒潮組的大鼠腦皮質(zhì)中VCAM-1陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見圖 2、圖 4）。

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)中VCAM-1的表達(dá)變化

圖4 各組大鼠腦皮質(zhì)中VCAM-1光密度值比較

2.2.3 腦組織中P一選擇素水平表達(dá)的變化 各組大鼠腦皮質(zhì)、海馬、丘腦中均可見P-選擇素陽性表達(dá)的神經(jīng)元細(xì)胞，尤以腦皮質(zhì)表達(dá)顯著。正常對(duì)照寒潮組與正常對(duì)照非寒潮組比較，大腦皮質(zhì)中的P-選擇素陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值無明顯差異 （P>0.05）。DM組與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠的腦皮質(zhì)中P-選擇素陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。DM寒潮組與DM非寒潮組比較，DM寒潮組的大鼠腦皮質(zhì)中P-選擇素陽性神經(jīng)元表達(dá)的光密度值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見圖 5、圖 6）。

圖5 各組大鼠腦皮質(zhì)中P-Selectin的表達(dá)變化

圖6 各組大鼠腦皮質(zhì)中P-選擇素光密度值比較

3 討論

研究表明寒冷是腦血管病發(fā)生的重要外部誘發(fā)因素。在嚴(yán)重的腦血管病變基礎(chǔ)上，寒潮作用后更易于促發(fā)腦卒中。本研究選取寒潮作為誘因，探討腦卒中的發(fā)病機(jī)制。

細(xì)胞粘附分子是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合，起粘附作用的膜表面糖蛋白。具有代表性的ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素均高表達(dá)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后表達(dá)大量的細(xì)胞粘附分子，即使無內(nèi)皮下組織暴露也可以與血小板附著。阻斷細(xì)胞粘附分子的異常表達(dá)可能抑制或消除腦卒中的發(fā)生和發(fā)展，因而細(xì)胞粘附分子在腦卒中的發(fā)生過程中具有極其重要的作用。因此本實(shí)驗(yàn)以建立糖尿病大鼠模型，通過寒潮進(jìn)行誘發(fā)腦卒中，探討極端氣候?qū)δX血管病發(fā)病的影響及其機(jī)制，預(yù)期為腦血管病防治提供理論依據(jù)。

許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明：腦梗塞后ICAM-1、VCAM-1或P-選擇素均有明顯表達(dá)上調(diào)[10-14]，臨床上也有研究進(jìn)一步表明：腦梗塞后腦組織中ICAM-1和血液中可溶性ICAM-1表達(dá)水平的增高[15-17]，與神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷密切相關(guān)。林健雯等[18]在人工寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)SD大鼠<220mmHg高血壓組中，寒潮亞組的腦血管內(nèi)皮 ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的 mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)比非寒潮亞組均有升高趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠腦組織內(nèi)ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素等水平明顯高于正常對(duì)照組，這提示DM對(duì)大鼠腦血管內(nèi)皮功能具有損傷作用，從而導(dǎo)致ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的表達(dá)上調(diào)。這可能與糖代謝紊亂引起糖化血紅蛋白升高、蛋白質(zhì)的非酶糖化、血小板功能異常、微循環(huán)障礙、組織缺血、缺氧等導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后使ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素等分泌增加有關(guān)。對(duì)照組大鼠在寒潮后ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的表達(dá)與寒潮前相比也略有增高，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而DM組大鼠經(jīng)歷3d人工寒潮后，腦組織內(nèi)ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的表達(dá)均明顯高于DM非寒潮組。這提示寒潮對(duì)正常大鼠腦血管內(nèi)皮影響并不明顯，而對(duì)長(zhǎng)期患有基礎(chǔ)疾病 （糖尿病）的大鼠影響非常大，極易導(dǎo)致心腦血管病的發(fā)生，甚至死亡的危險(xiǎn)。這與國內(nèi)外許多文獻(xiàn)報(bào)道寒冷對(duì)腦卒中具有促進(jìn)作用的觀點(diǎn)相一致。

細(xì)胞粘附分子參與寒冷促進(jìn)腦卒中發(fā)生的病理過程，其作用機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：⑴促凝作用；⑵促炎作用；⑶促進(jìn)興奮性氨基酸(EAA)、自由基、髓過氧化物酶(MPO)和蛋白水解酶等神經(jīng)毒性物質(zhì)的釋放。

本實(shí)驗(yàn)研究的均是卒中前的大鼠，我們認(rèn)為細(xì)胞粘附分子表達(dá)增高可能參與寒冷促使腦卒中發(fā)生的發(fā)病機(jī)制。目前也有許多在動(dòng)物試驗(yàn)中使用敲除細(xì)胞粘附分子[19，20]和抗細(xì)胞粘附分子抗體[21-23]對(duì)腦卒中模型進(jìn)行干預(yù)，取得了一定的效果，但臨床應(yīng)用尚待開拓，故還需進(jìn)一步研究來證實(shí)細(xì)胞粘附分子在腦血管疾病臨床和治療方面的作用機(jī)制，為腦卒中的預(yù)防和治療提供新的思路。