乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的再改良

王佳南 林建安 杜苗苗

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2018.33.029

[摘要] 目的 探求優(yōu)化的原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞方法。 方法 2017年6月1日—2017年6月2日選取泉州市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校提供6只出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠，采用2種不同消化心肌組織的方法，對(duì)照組予0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶逐次消化心肌組織;試驗(yàn)組予0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶消化數(shù)次后再單予 0.125%胰酶快速消化心肌組織;比較兩組取得的心肌細(xì)胞數(shù)量以及存活率，免疫熒光測(cè)肌鈣蛋白鑒定純度。 結(jié)果 2種方法均得到心肌細(xì)胞數(shù)量多[對(duì)照組（103.3±4.4），試驗(yàn)組（105.8±5.0）]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.911，P=0.384）;細(xì)胞即刻存活率試驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，試驗(yàn)組達(dá)91.87%，對(duì)照組即刻存活率僅68.07%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=81.0，P=0.025）。試驗(yàn)組存活率明顯高于對(duì)照組。結(jié)論 再改良方法提取心肌細(xì)胞，可獲得存活率高、活力好的心肌細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞] 心肌細(xì)胞;原代培養(yǎng);乳鼠

[中圖分類號(hào)] R813.11? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）11（c）-0029-03

乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于心血管疾病防治研究領(lǐng)域，其培養(yǎng)技術(shù)備受關(guān)注[1]。這一技術(shù)關(guān)鍵是如何獲得收獲率高、存活率高、純度高且生長(zhǎng)活力好的心肌細(xì)胞。近40多年來(lái)國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法作了多次的改進(jìn)，但影響心肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的因素較多，使得心肌細(xì)胞培養(yǎng)的收獲率、存活率及活力難以穩(wěn)定，參差不齊。因此該文在既往研究方法[2]基礎(chǔ)上于2017年6月1日—2017年6月2日選擇6只出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的再改良。

1? 材料與方法

1.1? 動(dòng)物出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠

由泉州市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2? 主要試劑

胰蛋白酶（Sigma）， I型膠原酶（Gibco），Ⅱ型膠原酶（Gibco）等。

1.3? 方法

①2017年6月1日于泉州市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)中心選取6只出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠，無(wú)菌下剪取心室心尖部分，在PBS液中充分洗滌，將其剪成糊狀，分成兩份置于離心管中待消化。

對(duì)照組每次予加入5 mL的0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液，每次消化10 min，如上消化6～7次。

試驗(yàn)組予加入5 mL 0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液，每次消化15 min，共2次，而后單予加入5 mL 0.125%胰酶快速消化剩余組織，每次5 min，如上消化6～7次。

收取對(duì)照組和試驗(yàn)組上清液，予終止消化，予過(guò)濾后離心（900 r/min，5 min），用胎牛血清重懸細(xì)胞液，接種于培養(yǎng)板中，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞（共2次），此后由具備良好心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)接種心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及管理，避免對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察的主觀性偏差（單盲）。

②對(duì)照組和試驗(yàn)組獲取心肌細(xì)胞，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)獲得細(xì)胞數(shù)量，共計(jì)數(shù)6次，取均值。獲得細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞。存活率=存活細(xì)胞數(shù)/ 細(xì)胞總數(shù)×100%，共計(jì)數(shù)40次，取均值。

③用DAPI標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核，免疫熒光抗肌鈣蛋白抗體試劑標(biāo)測(cè)細(xì)胞質(zhì)，檢測(cè)肌鈣蛋白抗體百分比來(lái)鑒定心肌細(xì)胞純度。

④心肌細(xì)胞的純度檢測(cè)采用免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)含有抗肌鈣蛋白抗體（CTNT）的百分比。細(xì)胞純度（%）=cTnT陽(yáng)性細(xì)胞染色數(shù)/DAPI核染細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4? 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPASS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析，兩組間計(jì)量資料比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，分別用（x±s）、百分率（%）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 比較獲取細(xì)胞數(shù)量及存活率

臺(tái)盼藍(lán)對(duì)收獲心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，死的細(xì)胞染藍(lán)色，存活細(xì)胞不染色，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及存活率。獲得心肌細(xì)胞數(shù)量上對(duì)照組和試驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.384），表1，對(duì)照組即刻存活率68.07%，試驗(yàn)組達(dá)91.87%，試驗(yàn)組的即刻存活率顯著高于對(duì)照組（P=0.025），見(jiàn)表2。

2.2? 測(cè)定心肌細(xì)胞

分別取對(duì)照組和試驗(yàn)組培養(yǎng)心肌細(xì)胞（由具備心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)其他實(shí)驗(yàn)室人員執(zhí)行），DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，熒光肌鈣蛋白抗體標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。用倒置熒光顯微鏡觀察，所有細(xì)胞DAPI染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（圖A）心肌細(xì)胞經(jīng)肌鈣蛋白抗體標(biāo)記后顯示綠色熒光（圖B）。

3? 討論

乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)目前作為心血管疾病研究的一項(xiàng)基本技術(shù)。傳統(tǒng)Simpson法在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)存在不足，其細(xì)胞收獲量及存活率很低，因此一些改進(jìn)方法應(yīng)運(yùn)而生。該研究在既往心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行再次改良，研究中采用了不同次序0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶+0.125%胰酶聯(lián)合消化方法，簡(jiǎn)單快捷的分離出較多數(shù)量的心肌細(xì)胞，獲取心肌細(xì)胞數(shù)量達(dá)6×106，此與近期其他文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]獲取心肌細(xì)胞數(shù)量相一致。歸其原因考慮心肌組織中含有多種類型的間質(zhì)膠原，單一消化酶難以把心肌組織充分解離成單個(gè)細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)中兩組均采用I型和II型膠原酶與胰酶組成混合消化酶，能較有效的把成團(tuán)心肌組織充分消化，把含有多種類型間質(zhì)膠原的心肌組織充分解離，因而兩組均獲得較多數(shù)量心肌細(xì)胞。在相關(guān)研究報(bào)道[5-7]中獲得心肌細(xì)胞存活率約在80%～90%左右不等，但文獻(xiàn)報(bào)道消化方法參差不齊，有的則較為繁瑣，而本試驗(yàn)中通過(guò)前期基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，改良試驗(yàn)組獲取心肌細(xì)胞存活率達(dá)91.87%，改良試驗(yàn)組獲得的心肌細(xì)胞存活率較其他研究報(bào)道的細(xì)胞存活率略有提高，而心肌組織的消化方法相比則更為簡(jiǎn)便。在該研究中對(duì)照組獲取細(xì)胞即刻存活率僅68.07%，與改良試驗(yàn)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為何兩組采用相同的混合消化酶消化心肌組織，但試驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯高于對(duì)照組，考慮與胰酶消化時(shí)間明顯相關(guān)。試驗(yàn)組采用5 mL 0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液消化15 min（共2次），而后加入5 mL 0.125%胰酶快速消化剩余組織5 min的消化次序，這樣先把心肌組織團(tuán)塊較長(zhǎng)時(shí)間置于溫和而對(duì)心肌細(xì)胞損傷極小的混合膠原酶中充分消化解離，把心肌團(tuán)塊消化解離成松散的心肌組織，而后迅速置于消化作用強(qiáng)而對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)較大的胰酶中快速消化，采用此種消化方法可縮短心肌組織和細(xì)胞損傷較強(qiáng)的胰酶消化液接觸時(shí)間，因而獲取細(xì)胞存活率高，而對(duì)照組予加入5 mL的0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液，每次消化作用10 min，共消化6～7次，采用此種消化方法，雖然亦可比較充分消化心肌組織，但心肌細(xì)胞和胰酶消化液總的接觸時(shí)間較長(zhǎng)，而胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞膜有較大破壞作用，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易過(guò)度消化損傷心肌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。心肌細(xì)胞原代培的影響因素眾多[8-9]，筆者經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)踐證實(shí)消化酶的選擇及消化方法是心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)最關(guān)鍵重要因素。傳統(tǒng)消化心肌細(xì)胞最常用的是胰蛋白酶，其分解細(xì)胞的組織間質(zhì)蛋白，然而其對(duì)細(xì)胞膜有較大損傷，假如濃度太高或消化時(shí)間太長(zhǎng)則容易過(guò)度消化心肌細(xì)胞，損傷心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜，使得心肌細(xì)胞喪失貼壁能力及心肌搏動(dòng)活力，此外心肌組織有很多膠原成分，單獨(dú)應(yīng)用胰蛋白酶消化心肌組織沒(méi)有辦法充分解離出多的單個(gè)細(xì)胞。而組織膠原酶，可分解細(xì)胞之間的膠原成分，本身對(duì)心肌細(xì)胞的損傷很小，把成團(tuán)的心肌組織塊分解成松散單個(gè)細(xì)胞很有好處，然而其溫和的分解作用，勢(shì)必導(dǎo)致消化組織需要耗時(shí)大量時(shí)間，此外，由于心肌組織間質(zhì)膠原具有多種類型，應(yīng)用某一種膠原酶效果亦有限，基于此，筆者采用了0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化方法，簡(jiǎn)單快捷的分離出良好的心肌細(xì)胞，用此法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞可以滿足各種體外試驗(yàn)的要求。

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（收稿日期：2018-08-25）