子宮內膜癌組織中miR-106b、DAB2 表達與臨床病理及預后的相關性

董愛華 韓 克

1．南京大學醫學院( 210093) ;2．南京鼓樓醫院

子宮內膜癌是常發生于子宮內膜中的一種上皮性惡性腫瘤，具有較高的發病率與死亡率，確診時多為中晚期，早期確診并有效治療可延長患者生存時間［1］。目前臨床常通過檢測血清標志物而診斷早期子宮內膜癌，但缺乏特異性及敏感性導致預后效果差，因而需尋找新的子宮內膜癌生物學標志物以提高臨床診療效果并有效評估預后［2］。miRNAs 是一類非編碼單鏈核苷酸RNA 分子，可通過與mRNA 3’UTR 區序列結合降解并抑制靶基因表達。有研究表明在胃癌組織中微小RNA106b ( miR-106b) 上調表達并促進腫瘤細胞的增殖及遷移［3］。惡性腫瘤的發生與癌基因及抑癌基因的活性狀態有關，殘疾基因同源物2( DAB2) 是一種抑癌基因并可在多種腫瘤發生發展進程中發揮重要作用［4］。目前關于miR-106b 與DAB2 在子宮內膜癌組織中的表達研究相對較少，為此，本研究探討子宮內膜癌組織中miR-106b 與DAB2 表達水平與臨床病理特征的關系，探究其預后評定價值。

1 資料與方法

1．1 一般資料

收集2010 年5 月—2015 年2 月本院手術切除的子宮內膜癌病例資料70 例( 觀察組) ，年齡( 36．2±2．6) 歲( 31～65 歲) ，均經病理證實為子宮內膜癌。收集臨床病理資料包括FIGO 分期、淋巴結轉移、組織學分級、肌層浸潤、P53 及Ki67 表達等。按照FIGO 分期標準［5］分為I 期34 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期15例;根據組織內膜癌分級法［6］分為G1 期16 例，G2期44 例，G3 期10 例。P53、Ki67 呈棕黃色或棕褐色顆粒標記為陽性，以陽性細胞占每個視野下全部腫瘤細胞的平均比例作為量化指標:即P53，陽性細胞數≥10%為陽性( +) ，＜10%為陰性( -) ;Ki67，陽性細胞數≥14%為陽性( +) ，＜14%為陰性( -) 。另選取同期于本院進行子宮內膜癌切除手術70 例患者的癌旁正常組織標本為正常組，年齡( 36.6±3．3) 歲(32～71 歲) 。納入標準: 患者術前未接受化療或放療以及激素治療，知情且簽署知情同意書。排除標準:①患有多處原發性腫瘤;②患有其他腫瘤或重大疾病病史;③肝腎等重要器官嚴重損傷;④臨床資料不完整。兩組患者年齡比較無差異( P＞0．05) 。

1．2 實驗室檢測方法

1．2．1 子宮內膜組織中miR-106b、DAB2 表達檢測采用Trizol 法( 北京恩碩生物科技有限公司) 提取子宮內膜組織標本總RNA，DEPC 水溶解RNA 并測定RNA 濃度及純度。利用反轉錄試劑盒( 天根生化科技( 北京) 有限公司) 將RNA 反轉錄為cDNA。按照SYBR Green qRT-PCR 試劑盒( 北京恩碩生物科技有限公司) 說明書進行檢測，其中miR-106b 上游引物序列為: 5’-TTTTCGCCCTTAGCGTGAAGA-3 ’， 下 游 引 物 序 列 為: 5 ’ - GAGGCAGTCGAAGCTCTCG -3’，以U6 為內參基因，上游引物序列為: 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，DAB2 上游引物序列為: 5’-TGGACGATGTGCTCT ATGCC-3’，下游引物序列為: 5’-GGATGGTGATGGTTTGGTAG-3’，以β?actin 為內參基因，上游引物序列為: 5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’，下游引物序列為:5’-GTAGTTTCG TGGATGCCACAG-3’。qRT-PCR 反應體系為15 μl，其中cDNA 1 μl，引物各0．5 μl，SYBR Green Mix 7．5 μl，RNase-free ddH2O5．5 μl。每個樣品為3 個生物學重復，在實時熒光定量RCR 儀上進行反應，程序設置為95 ℃10 min;95℃15s、60 ℃15s，72 ℃15s，共40 個循環。反應結束后將數據保存并對所得數據Ct 值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-106b 與DAB2 mRNA 相對表達量，并分析miR-106b 與DAB2 表達與患者臨床病理特征的關系。

1．2．2 子宮內膜組織中DAB2 蛋白表達檢測 按照免疫組化試劑盒( 美國Bioassay Technology 公司) 說明書檢測組織中DAB2 蛋白表達。將子宮內膜組織制作成石蠟切片，梯度脫水、PBS 清洗后置于檸檬酸鈉溶液( pH7．2～7．4) 中20 min 抗原修復，PBS 清洗后加入稀釋1:100 的DAB2 一抗( 上海優寧維生物科技股份有限公司) 并置于4 ℃冰箱過夜，次日PBS沖洗標本并滴加生物素標記二抗( 北京九州天瑞卡機有限公司) ，37 ℃孵育30 min 后滴加DAB( 福州邁新生物技術開發有限公司) 顯色10 min，蘇木精復染后用蒸餾水清洗，滴加二甲苯后封片光學顯微鏡下觀察。

1．2．3 結果判定 DAB2 主要位于細胞質，染色呈黃色、棕黃色、棕褐色，挑選每張切片較清晰的7 ～10個視野統計陽性染色細胞數量，根據陽性細胞數與染色程度綜合評判結果［7］: 陽性細胞＜25%為0 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。染色程度，未著色為0 分，黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。兩項相加之和為0 ～1 分為陰性( -) ，2～3 分為弱陽性( +) ，4 ～5 分為陽性( ++ ，≥6分為強陽性( +++) ，將( +、++、+++) 作為陽性表達組，( -)作為陰性表達組。

1．3 隨訪

所用患者均于本院建立資料并通過電話、門診等隨訪3 年，統計患者開始治療到腫瘤進展或死亡時間即無生存進展期( PFS) 。

1．4 統計學方法

采用統計學軟件SPSS19．0 進行數據分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差( 珋x±s) 表示，兩組間比較采用t 檢驗;計數資料用［n( %) ］表示，采用檢驗;Pearson 法進行相關性分析;采用Kaplan-Meier 分析患者生存情況。以P＜0．05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 子宮內膜組織中miR-106b、DAB2 表達

觀察組miR-106b 表達水平( 3．18±0．10) 高于正常組( 1．05±0．34) ，而DAB2 表達水平( 0．30±0.02)低于正常組( 1．03±0．05) ( P＜0．05) 。

2．2 子宮內膜組織中DAB2 蛋白表達

免疫組化檢測子宮內膜組織中DAB2 蛋白表達結果顯示，DAB2 位于細胞質，染色呈黃色、棕黃色、棕褐色。觀察組中DAB2 蛋白陽性表達率低于正常組( P＜0．05) 。詳見表1。

2．3 miR-106b、DAB2 表達與臨床病理特征的關系

miR-106b 表達量中位值為2．12±0．25，高于中位值有42 例( 高表達) ，余28 例低于中位值( 低表達) 。臨床病理分析結果顯示，miR-106b 表達與FIGO 分期、淋巴結轉移、組織學分級、P53 及Ki67 有關，DAB2 表達與FIGO 分期、肌層浸潤程度、P53 及Ki67 有關( P＜0．05) 。詳見表2。

表1 兩組子宮內膜組織中DAB2 蛋白表達情況比較(例)

表2 觀察組內膜組織miR-106b、DAB2 表達與臨床病理特征關系［例(%)］

2．4 miR-106b 與DAB2 表達相關性分析

Pearson 相關性分析顯示，miR-106b 與DAB2 表達呈負相關( r=-0．358，P=0．012) 。見圖1。

2．5 子宮內膜癌組織中miR-106b、DAB2 表達與預后關系

Kaplan-Meier 曲線顯示miR-106b、DAB2 表達與PFS 相關，miR-106b 低表達組PFS( 40．0%) 高于高表達組(20．0%)，DAB2 陽性表達組PFS(38．6%) 高于陰性表達組(21．4%) ( P＜0．05) ，見圖2。將影響子宮內膜癌患者預后的危險因素進行Cox 多元回歸分析，結果顯示miR-106b、DAB2 表達、組織學分級及肌層浸潤程度均是患者預后的危險因素。見表3。

圖1 miR-106b 與DAB2 表達水平相關性分析

表3 子宮內膜癌患者預后的危險因素分析

圖2 miR-106b、DAB2 表達與PFS 的關系

3 討論

子宮內膜癌根據發生原因可分為雌激素依賴型與非雌激素依賴型，前者主要源于子宮內膜增生，后者包括子宮內膜漿液性癌、黏液癌、腺鱗癌等［8］。目前臨床實踐中主要依據病理類型進行診斷，但無法準確評估病理分期等腫瘤生物學特征，因此依靠特異性及敏感性較高的分子標記物從而掌握腫瘤生物學行為具有重要臨床意義。miRNAs 可通過調控下游靶基因蛋白表達并介導基因轉錄后，一個或多個共同調控蛋白編碼基因［9］。研究表明miRNAs 參與細胞增殖等細胞生命活動過程并對腫瘤發生發展發揮重要作用［10］。探討子宮內膜癌細胞轉移或侵襲有關的miRNAs 與靶基因，對早期診治及評估預后具有重要應用價值。

miR-106b 位于人類7 號染色體且在編碼基因MCM7 的第13 個內含子區域內，研究表明miR-106b在前列腺癌中上調表達并促進癌細胞增殖即發揮促癌功能［11］。肝癌組織中miR-106b 高表達進而促使E-Cadherin 等上皮或間質細胞標志物下調表達從而促進肝癌細胞增殖及侵襲［12］。在胃癌組織中miR-106b 上調表達而靶基因Smad7 下調表達，通過促使腫瘤細胞增殖進而參與胃癌發生發展過程［13］。近來相關研究表明乳腺癌組織中miR-106b 上調表達可活化TGF?β 通路從而促使上皮間質發生轉化導致癌癥發生［14］。目前關于miR-106b 在子宮內膜組織中的表達及與臨床病理關系的研究相對較少。

本研究檢測子宮內膜癌組織miR-106b 的表達水平顯著高于正常組織，說明miR-106b 可能參與子宮內膜癌細胞侵襲及遷移過程。進一步分析miR-106b 表達與患者臨床病理特征關系顯示，miR-106b表達與FIGO 分期、淋巴結轉移、組織學分級、P53 及Ki67 呈正相關，且P53、Ki67 陽性表達與子宮內膜癌的生物學行為及預后不良相關［15］。說明miR-106b 表達與腫瘤組織分化、惡化程度密切相關，推測其可作為診斷子宮內膜癌的分子標記物。

DAB2 是一種磷蛋白，研究表明miR-106b 可調控靶蛋白DAB2 表達而促進宮頸癌細胞上皮間質轉化導致腫瘤細胞增殖分化［16］。DAB2 可參與絲裂原信號轉導通路，同時DAB2 與結合蛋白相互作用可參與胞外信號調節激酶等多種腫瘤相關信號途徑［17］。有報道證實在前列腺癌中DAB2 表達下調從而影響血管生成及腫瘤細胞存活或凋亡等生物學過程［18］。研究表明DAB2 是一種抑癌基因并可在腫瘤發生發展過程中發揮作用，肝癌組織中DAB2下調表達并與腫瘤病理分級及預后相關［19］。本研究檢測子宮內膜癌組織中DAB2 表達顯著低于正常組，且免疫分析DAB2 蛋白陽性表達率低于正常組，說明DAB2 參與子宮內膜癌發生及發展。臨床病理特征結果顯示DAB2 表達與FIGO 分期、肌層浸潤程度、P53 及Ki67 正相關，說明DAB2 表達可能作為判斷病情發展的參考指標。Pearson 相關性分析顯示出miR-106b 與DAB2 表達呈負相關，說明子宮內膜癌中miR-106b 可通過下調靶基因DAB2 表達促使腫瘤細胞增殖及侵襲導致病情惡化。對子宮內膜癌患者預后分析顯示，miR-106b 低表達組PFS 高于高表達組，DAB2 陽性表達組PFS 高于陰性表達組。將影響子宮內膜癌患者預后的危險因素進行Cox 多元回歸分析，結果顯示miR-106b、DAB2 表達均是患者預后的危險因素，說明二者不僅與子宮內膜癌預后相關，且均是患者生存時間的危險因素。提示miR-106b、DAB2 表達與子宮內膜癌發生發展相關，二者可預測病情嚴重程度并可作為評估預后的有效指標。

綜上所述，子宮內膜癌組織中miR-106b 上調表達，而DAB2 下調表達，二者呈負相關關系且均與患者臨床病理特征及預后相關，二者均可作為臨床診斷子宮內膜癌及評估患者預后的分子標記物。本研究也存在不足之處，miR-106b 與DAB2 在子宮內膜癌中的生物學功能還有待進一步研究。