內源性大麻素系統在PCOS 大鼠模型子宮內膜中表達變化研究

王麗麗 崔 娜 趙志明 王 瑋 張樹成 王 寧 石翠格 郝桂敏*

1．河北醫科大學第二醫院( 石家莊，050000) 2．國家衛生計生委科學技術研究所

多囊卵巢綜合征( PCOS) 是育齡女性常見的內分泌紊亂疾病，發生率5%～10%［1］。PCOS 患者妊娠易出現一些臨床妊娠并發癥［2］。一些研究證明PCOS 患者的子宮內膜功能和表型存在異常［3］。內源性大麻素系統( ECS) 可參與調控能量代謝、控制胰島素分泌、維持血脂水平及性激素等，內源性大麻素受體1( CB1) 可表達于子宮及輸卵管、卵巢的皮質和髓質［4-5］。內源性大麻素花生四烯酸乙醇胺( AEA) 信號通路參與胚胎發育和改善子宮內膜容受性，使種植前胚胎與子宮內膜種植窗期保持同步化［6］。ECS 信號過高或過低都會損害胎盤植入和分娩過程［7-8］。PCOS 女性代謝紊亂影響子宮內膜，可能增加妊娠并發癥的風險，對后代造成影響［9］。本研究通過建立PCOS 大鼠模型，研究ECS 信號在子宮內膜組織中的表達變化，探究PCOS 患者子宮內膜蛻膜化調控機制，為臨床診治提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

4～5 周齡SD 大鼠30 只( 河北醫科大學動物室購買，動物室溫度21 ～22℃，濕度55%～65%，12 h/12h 光照黑暗周期) ，每籠3 ～5 只。動物可自由攝水攝食。

1．2 主要試劑及配制

來曲唑( 美國sigma) ;羧甲基纖維素( 北京索萊寶有限公司) ; 反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒( 日本Takara) 。1%羧甲基纖維素: 1g 羧甲基纖維素溶于100ml dd H2O 中。

1．3 PCOS 動物模型建立

將SD 大鼠隨機分為3 組，每組7 只。①PCOS組:每天給予大鼠來曲唑( 1mg/kg 劑量) 灌胃，給藥21 天，建立PCOS 大鼠模型; ②對照組: 給予同等體積的1%的羧甲基纖維素，連續定時灌服21 天;③空白組:不作任何處理。

1．4 標本數據采集與處理

每日對各組大鼠進行陰道涂片并HE 染色，判斷動情周期變化。每3 日對各組大鼠稱重并記錄。給藥21 天后，稱重，用3%的戊巴比妥鈉麻醉，用摘除眼球法取血，離心取血清，-20℃保存備用。取出雙側卵巢子宮分別稱重后，一側卵巢和子宮置于4%的多聚甲醛中固定，另一側卵巢和子宮分別于-80℃凍存備用。

1．5 實時熒光定量PCR 分析

①目的基因引物的合成: 引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。引物序列見表1。提取大鼠子宮內膜組織總RNA 并檢測其質量，進行反轉錄，熒光定量PCR 采用CFX96 序列檢測系統。在含有10μl TB Green Premix Ex Taq II、6μl ddH2O、2μl cDNA 以及上、下游各0．8μl 的20μl 總反應體系中，進行如下擴 增:95 ℃預變性30s;95℃5s，60℃30s 共進行40 個循環。待測樣品分別以內參基因( β?actin) 作為參照，每個樣品重復3 次，以3 次得到的Ct 值的平均值為最終測定結果。

1．6 統計學分析

研究所得數據均利用SPSS 20．0 進行統計，數據均以均值±標準差( 珋x±s) 表示，行獨立樣本t 檢驗，P＜0．05 為差異具有統計學意義。

表1 基因引物序列

2 結果

2．1 PCOS 大鼠模型的建立

隨著給藥時間的延長，PCOS 組雌鼠的平均體重逐漸高于對照組，兩周后高于對照組( P＜0．05) ;3周后PCOS 組子宮重量比對照組明顯降低，卵巢重量明顯升高( 均P＜0．05) 。見圖1。

圖1 PCOS 組和對照組體重、子宮和卵巢重量比較

2．2 動情周期

陰道涂片HE 染色結果觀察動情周期顯示，對照組動情周期規律，一般4～5 天。PCOS 組在給予來曲唑前兩周動情周期規律，用藥第12 天后大部分雌鼠無規律的動情周期，基本處于動情間期。見圖2。

2．3 子宮、卵巢大體形態學觀察

與對照組相比，PCOS 組子宮較細，卵巢體積較大。見圖3、圖4。

2．4 內源性大麻素系統分子在大鼠子宮中的表達

Real-time PCR 結果顯示，與對照組比較，PCOS組內源性大麻素受體CB1 和內源性大麻素合成酶NAPEPLD 的表達量明顯升高，水解酶FAAH 表達量明顯降低( 均P＜0．05) ; 內源性大麻素受體CB2表達量無統計學差異( P＞0．05) 。見圖4。

圖2 對照組(A)和PCOS 組(B)老年期動情周期變化

圖3 大鼠子宮大體形態圖

圖4 大鼠子宮內膜中內源性大麻素系統相關分子和NAPEPLD 的mRNA 表達量比較

3 討論

育齡期PCOS 患者生育能力下降甚至不孕，主要表現:不孕，自然流產風險增加，妊娠期并發癥風險增加。妊娠早期自發流產可能與滋養層入侵和胎盤形成異常有關［10-12］，導致滋養層入侵和胎盤異常的原因之一可能與子宮內膜蛻膜化異常。子宮內膜蛻膜化異常可能是PCOS 患者后續妊娠并發癥發生的關鍵因素之一。因此，研究內源性大麻素在PCOS 子宮內膜中的表達，對進一步了解PCOS 患者妊娠并發癥發病機理具有重要意義。

PCOS 患者多表現為排卵和胚胎著床及受孕障礙。目前尚無有效治療方法。由于人群中病例材料獲取十分困難，因此合適的動物模型對研究PCOS致病機理和診療策略極為必要。本研究選用SD 大鼠作為實驗動物［13］，采用來曲唑建立PCOS 大鼠模型，灌胃給予來曲唑21 天后，PCOS 組體重明顯高于對照組，動情周期發生紊亂，卵巢重量明顯升高，子宮重量明顯下降，與文獻報道的PCOS 大鼠模型一致。說明本次研究成功建立了大鼠PCOS 模型。文獻報道，來曲唑誘導PCOS 大鼠模型血清雌激素水平降低［14］。在卵巢去勢的大鼠模型中，給予雌激素和孕酮后，子宮上皮和基層中FAAH 水平明顯升高［15］。但在卵巢去勢的大鼠模型中，單獨給予雌激素后，子宮上皮和腺體中CB1、CB2、NAPE-PLD、FAAH 表達均明顯升高［16］。說明在來曲唑誘導PCOS 大鼠模型中，可能是雌激素和孕激素共同參與調節其體內ECS 的表達。

Real-time PCR 結果顯示，與對照組相比，PCOS組大鼠子宮內膜CB1 和NAPEPLD mRNA 表達量明顯升高，FAAH mRNA 表達量明顯降低。說明在PCOS 大鼠子宮內膜中內源性大麻素系統分子CB1、NAPEPLD 和FAAH 表達發生改變。說明子宮中ECS 的變化可能對后續妊娠蛻膜化產生重要影響。有研究表明小鼠子宮AEA 水平下降會增加子宮內膜容受性［17］。Fonseca 研究發現，在大鼠蛻膜化發育的階段中，高水平NAPE-PLD 提高了AEA 水平，從而參與蛻膜重塑過程，待蛻膜化形成后FAAH 水平發生高表達，證實了AEA 代謝酶在早期妊娠信號傳導中的關鍵調節作用［18-19］。

綜上，本研究建立的PCOS 大鼠模型子宮中ECS 異常，該結果也為今后利用此模型研究ECS 與PCOS 致病機理，以及與妊娠結局關系提供基礎。