圓滑番荔枝抑菌活性成分分離

茍亞峰 孫世偉 高圣風(fēng) 孟倩倩 王政 劉愛(ài)勤

摘? 要? 為進(jìn)一步分離圓滑番荔枝中抑菌活性成分，以胡椒瘟病菌為供試病原菌，采用硅膠層析柱對(duì)圓滑番荔枝葉乙醇提取物中抑菌活性成分進(jìn)行了初步分離。結(jié)果表明：從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離得到的D1、D2、D3、....D10等10種餾分中D1、D4、D5、D7、D8對(duì)胡椒瘟病菌具有抑菌活性，抑菌率分別達(dá)到了68.10%、65.95%、63.44%、76.34%和50.18%。對(duì)D1組分進(jìn)一步分離得到D1-1純化合物，通過(guò)核磁共振氫譜、碳譜確定其為棕櫚酸酰胺。本研究為進(jìn)一步研制防治胡椒瘟病的植物源殺菌劑提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 圓滑番荔枝 ;胡椒瘟病菌 ;餾分 ;抑菌活性

中圖分類號(hào)? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? ? Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.11.005

Isolation of Antifungal Activity of Annona glabra

GOU Yafeng1，2）? SUN Shiwei1，2）? GAO Shengfeng1，2）

MENG Qianqian1，2）? WANG Zheng1，2）? LIU Aiqin1，2）

（1 Research Institute of Spice and Beverage Crops，CATAS，Wanning， Hainan 571533;

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and

Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops，Wanning，Hainan 571533）

Abstract? Annona glabra was extracted with ethanol and its components with antifungal activity were isolated by column chromatography with Phytophthora capsici as test pathogen. The results showed that 10 components with antifungal activity were isolated from the ethanol extract， of which components D1， D4， D5， D7 and D8 had inhibitory effect on Phytophthora capsici， and their inhibition rates were 68.10%， 65.95%， 63.44%， 76.34% and 50.18%， respectively. The component D1 was isolated further to produce pure compound D1-1 which was determined as palmitamide by using hydrogen spectrum and carbon spectrum in nuclear magnetic resonance. This study provided evidence for the further development of botanic fungicides against phytophthora foot rot of black pepper.

Keywords? Annona glabra ; Phytophthora capsici ; fraction ; antifungal activity

從天然產(chǎn)物，特別是從植物體中發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥活性物質(zhì)，直接利用其原材料創(chuàng)制新農(nóng)藥，或者從天然產(chǎn)物中尋找先導(dǎo)化合物，是近年來(lái)新農(nóng)藥創(chuàng)制的主要途徑。張興等[1]報(bào)道植物源農(nóng)藥除了防治有害生物以外，還表現(xiàn)出明顯的肥效、增產(chǎn)作用，同時(shí)在調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)、提高植物免疫、抗逆以及產(chǎn)品保鮮方面亦具有明顯功效。近年來(lái)，植物源殺菌劑的研發(fā)有了較大進(jìn)展。

圓滑番荔枝（Annona glabra Linn.）是番荔枝科（Annonaceae）番荔枝屬（Annona）植物，常綠喬木。原產(chǎn)熱帶美洲，現(xiàn)亞洲熱帶地區(qū)也有栽培。我國(guó)云南、廣西、廣東、浙江、臺(tái)灣和海南等省均有栽培[2]。有研究報(bào)道，番荔枝科植物含有生物堿、萜類、黃酮、番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯等成分，具有驅(qū)蟲(chóng)、抗病毒、殺蟲(chóng)、抗癌等多種生理活性[3-4]。對(duì)該屬植物活性篩選發(fā)現(xiàn)，圓滑番荔枝有較強(qiáng)的抑制腫瘤的生理活性。茍亞峰等[5-6]研究報(bào)道了圓滑番荔枝乙醇提取物乙酸乙酯萃取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。因此，本試驗(yàn)以胡椒瘟病菌為供試病原菌，采用活性跟蹤法[7]分離圓滑番荔枝葉乙醇提取物中抑菌活性成分，為進(jìn)一步研制防治胡椒瘟病的植物源殺菌劑提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試材

圓滑番荔枝葉采自中國(guó)協(xié)和醫(yī)學(xué)科院藥用植物研究所海南分所院內(nèi)。將新鮮的圓滑番荔枝葉充分陰干，粉碎后置通風(fēng)、避光處儲(chǔ)藏備用。

胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所病蟲(chóng)害防控研究室提供。

1.2? 方法

1.2.1? 乙醇提取物的制備

采用冷浸法：準(zhǔn)確稱取5 kg的圓滑番荔枝葉干粉裝入廣口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇分別浸提72、48和24 h后過(guò)濾，每個(gè)處理3次重復(fù)，合并3次濾液并減壓濃縮，獲得圓滑番荔枝葉乙醇提取物浸膏857.50 g，放置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2? 乙酸乙酯萃取組分的制備

采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯等3種不同極性溶劑對(duì)1.2.1中制備的乙醇提取物浸膏進(jìn)行依次萃取，合并萃取液并濃縮后分別得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯的萃取組分，放置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3? 抑菌活性成分分離

通過(guò)生物活性跟蹤法[7]，采用硅膠層析柱，對(duì)圓滑番荔枝乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中抑菌活性成分進(jìn)行分離純化。具體方法如下：將大孔樹(shù)脂濕法裝柱，用適量的溶劑溶解40 g乙酸乙酯萃取組分，上樣，依次用體積比石油醚∶二氯甲烷[3∶1、 1∶1和0∶1]，二氯甲烷∶甲醇[200∶1、 100∶1、 50∶1、30∶1、20∶1、10∶1和1∶1]為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。每一個(gè)梯度分別洗脫1 500 mL，以200 mL為單位接收流出液，根據(jù)薄層色譜點(diǎn)板反洗和單質(zhì)碘顯色結(jié)果，合并相近組分，得到不同餾分。

1.2.4? 抑菌活性測(cè)定

以胡椒瘟病菌為供試病原菌，測(cè)定各餾分的抑菌活性，具體參照菌絲生長(zhǎng)速率法[8-9]測(cè)定分離的化合物對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性。根據(jù)樣品量和活性選擇其中一個(gè)抑菌活性較強(qiáng)的餾分繼續(xù)進(jìn)行分離：先經(jīng)硅膠柱層析分離，然后用石油醚∶乙酸乙酯體積比0∶1、5∶1洗脫，獲得白色固體經(jīng)重結(jié)晶得到化合物。

1.2.5? 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)分離得到的化合物通過(guò)熔點(diǎn)及TLC檢測(cè)、氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）等譜圖數(shù)據(jù)分析并結(jié)合文獻(xiàn)，確定化合物結(jié)構(gòu)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 各餾分抑菌活性測(cè)定

對(duì)圓滑番荔枝乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中抑菌活性成分進(jìn)行分離純化，獲得10個(gè)餾分（D1～D10），參照1.2.4的方法，測(cè)定這10個(gè)餾分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1中可以看出，D1、D4、D5、D7、D8對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌率均達(dá)到了50%以上，分別是68.10%、65.95%、63.44%、76.34%和50.18%，D1和D7的抑菌活性較高，其抑菌活性成分有待進(jìn)一步分離。

2.2? 對(duì)D1餾分分離的化合物進(jìn)行初步鑒定

將D1（1.87 g）經(jīng)硅膠柱層析分離，用石油醚∶乙酸乙酯體積比0∶1、5∶1洗脫，得白色固體經(jīng)重結(jié)晶得到化合物D1-1。通過(guò)核磁共振譜（1H-NMR和13C-NMR）初步鑒定分離的化合物D1-1結(jié)構(gòu)，D1-1為白色蠟狀固體，1H-NMR （400 MHz，CDCl3）：δ 2.38 （t，J=7.4 Hz，2H），1.60-1.52 （m，2H），1.32-1.21 （m，24H），0.88 （t，J=6.7 Hz，3H）;13C-NMR （101 MHz，CDCl3）：δ 173.4，42.8，31.9，29.8，29.7，

29.6，29.5，29.4，29.3，29.2，23.9，22.7，14.1，根據(jù)已發(fā)表數(shù)據(jù)[10]，D1-1鑒定為棕櫚酸酰胺（譜圖見(jiàn)圖1、2），分子式為CH3（CH2）14COONH2。

3? 討論與結(jié)論

田麗娟等[11-13]對(duì)圓滑番荔枝的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，分離得到二萜類和生物堿類化合物。本研究從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離得到的10種餾分D1、D2、D3、...D10中D1、D4、D5、D7、D8對(duì)胡椒瘟病菌抑菌率分別達(dá)到了68.10%、65.95%、63.44%、76.34%和50.18%。對(duì)D1組分進(jìn)一步分離得到D1-1純化合物，通過(guò)核磁共振氫譜、碳譜確定其為棕櫚酸酰胺，與孫蘭等[10]從圓滑番荔枝種子中分離得到棕櫚酸酰胺的結(jié)果是一致的。但棕櫚酸酰胺是從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中的低極性餾分中分離得到的，其抑菌活性還有待進(jìn)一步研究。

有關(guān)圓滑番荔枝活性研究主要集中在醫(yī)藥上。姜盼等[14]綜述了圓滑番荔枝的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展，為進(jìn)一步對(duì)其藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。張永紅等[15]從圓滑番荔枝中分離得到2種二萜類化合物，并標(biāo)明該2種化合物對(duì)腫瘤具有較好的抑制作用，有望開(kāi)發(fā)為新的抗腫瘤藥物。國(guó)外也有圓滑番荔枝作為傳統(tǒng)藥物被用于防治包括癌癥在內(nèi)的人類疾病報(bào)道。Curtis Bruce等[16]報(bào)道，與抗癌藥物阿霉素相比，圓滑番荔枝種子酒精提取物明顯降低了細(xì)胞毒素水平，增加了細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素積累。但目前對(duì)圓滑番荔枝抑菌作用方面的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，其抑菌作用有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 張? 興，吳志鳳，李? 威，等. 植物源農(nóng)藥研發(fā)與應(yīng)用新進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，2013，34（4）：24-31.

[2] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，2004：170.

[3] 李艷芳，符立梧.番荔枝內(nèi)酯抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20（3）：245-247.

[4] 朱? 峰，劉曉紅，丁健華，等. 番荔枝活性化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，20（4）：62-70.

[5] 茍亞峰，劉愛(ài)勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對(duì)胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 植物保護(hù)，2010，36（6）：128-131.

[6] 茍亞峰，孫世偉，高圣風(fēng)，等. 圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性測(cè)定[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34（4）：1-3.

[7] 楊震發(fā)，袁呈山，楊順義. 黃花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究[J]. 植物保護(hù)，2014，40（6）：59-64.

[8] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[9] 慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994：79-81.

[10] 孫? 蘭，朱久香，余競(jìng)光，等. 圓滑番荔枝種子化學(xué)成分研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（1）：32-36.

[11] 田麗娟，韓? 英，孟正木，等. 圓滑番荔枝的化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（1）：10-12.

[12] 田麗娟，楊念云，孟正木，等. 圓滑番荔枝的化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（4）：258-260.

[13] 常世忠，張笑松，方? 薇. 圓滑番荔枝的化學(xué)成分研究[J]. 安徽醫(yī)藥，2002，6（1）：14.

[14] 姜? 盼，陳? 鍇，程寶奇，等. 圓滑番荔枝的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2011，42（12）：2 564-2 570.

[15] Yonghong Zhang， Haiyan Peng， Guohao Xia， et al. Anticancer effect of two diterpenoid compounds isolated from Annona glabra Linn[J]. Acta Pharmacol Sin， 2004， 25（7）： 937-942.

[16] Curtis Bruce Cochrane， P.K. Raveendran Nair， Steven J.Melnick，et al. Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human Leukemia Cell Lines[J]. Anticancer research， 2008（28）： 965-972.